抑制光敏色素B-4 #3减少pif激活基因的表达，增加生长抑制因子的表达，以调节下胚轴伸长

光敏色素B-4 #3的抑制因子(SUPPRESSOR OF PHYTOCHROME B-4 #3, SOB3)是AT-HOOK MOTIF CONTAINING NUCLEAR localization (AHL)家族的转录因子，参与光介导的植物生长拟南芥，影响下胚轴伸长等过程。大多数关于ahl的研究都是在连续光下进行的。然而，与持续光照条件相比，有一些独特的分子事件可以促进短日(SD)内的生长。因此，我们研究了AHLs如何影响SD下胚轴伸长。首先，我们观察到AHLs在SD中抑制下胚轴的生长，这与它们在恒定光照下的作用相似。接下来，我们通过对两个sd生长的幼苗进行RNA-seq鉴定了ahl调控基因sob3不同时间点的突变体。我们的转录组数据表明了这一点光敏色素相互作用因子（论坛s)4，5，7,8以及pif靶基因被SOB3和/或其他ahl抑制。我们还确定了PIF靶基因被抑制，以前没有被描述为ahl调节，包括Pre1 pil1 hfr1，CDF5,而且XTR7．有趣的是，我们的RNA-seq数据也表明，AHLs激活生长抑制因子的表达来控制下胚轴伸长，如HY5而且IAA17．值得注意的是，从RNA-seq实验中鉴定出的许多生长调节基因和其他基因在这两者之间被差异调节sob3测试时间点的变种人。令人惊讶的是，我们的ChIP-seq数据表明，SOB3在一天中主要与相似的基因结合。总的来说，这些数据表明AHLs以特定时间点的方式影响基因表达，而与整个SD中与DNA结合的变化无关。

植物有一套复杂的信号通路，使它们能够解释和回应周围的环境。植物根据环境信号改变生长发育的一种机制是通过改变基因转录。参与这一过程的一组重要转录调控因子是AT-HOOK MOTIF NUCLEAR localization (AHL)家族的成员[1，2，3.］．在拟南芥(拟南芥)，AHL29/ SUPPRESSOR OF PHYTOCHROME B4-#3 (SOB3)具有调节生长发育的重要功能，以响应光，影响下胚轴生长、开花和衰老等过程[1，4，5，6，7，8，9，10］．SOB3在长下胚轴表型抑制因子的激活标记筛选中被确定为下胚轴生长的抑制因子光敏色素B-4（phyB-4)白光下生长的感光突变体[1，11，12，13］．进一步的研究表明，SOB3以光依赖的方式调节下胚轴的生长，特别是在昏暗的光线下影响生长[1］．因此,SOB3-Dominant（SOB3-D)的幼苗，从上述活化标记实验中得到的SOB3与野生型Col-0植物相比，下胚轴较短[1，5］．除SOB3外，其他ahl与该家族成员以半冗余的方式调节下胚轴生长[6］．

的AHL基因家族的特征是两个对其功能重要的保守元件:一个植物和原核生物保守/未知功能域#296 (PPC/DUF296)和一个或两个AT-hook motif [6，14，15］．SOB3通过PPC结构域与自身、其他ahl和非ahl转录因子相互作用[6］．另一方面，AT-hook motif结合了富含腺嘌呤和胸腺嘧啶的DNA序列[4，6，16，17，18］．值得注意的是，在AT-hook结构域的中心有一个错义突变SOB3在SOB3-D背景，称为sob3-6等位基因，产生极高的幼苗[1］．这种表型归因于非功能性SOB3-6蛋白过表达的显性-负性效应，即SOB3-6蛋白可以像正常情况下那样参与蛋白-蛋白相互作用，但不能与DNA结合[6］．这导致了不能抑制幼苗生长的非生产性复合物的形成。从这项研究中，我们发现AT-hook和PPC结构域对SOB3和其他ahl的功能都很重要。

AHLs在恒定光照和长日照条件下调节生长(LD;光照16小时/暗8小时)，至少部分通过抑制生长素途径。在恒定光照下生长的幼苗中，SOB3直接与生长素生物合成基因的启动子结合YUCCA8（YUC8)和生长素信号基因属于小生长素上升RNA 19（SAUR19)亚家族并抑制其转录[5］．然而，SAUR19的过表达只能部分恢复下胚轴短的表型SOB3-D这表明AHLs对生长的影响并不能完全通过其对生长素途径的影响来解释。在另一项使用在LD中生长的幼苗的研究中，Lee和Seo发现AHLs会抑制YUC9转录通过促进H2A的沉积。该基因启动子上的Z组蛋白变体[8］．这可能会抑制生长素的生物合成，从而抑制老年幼苗的下胚轴生长。此外，另一项使用ld生长的植物的研究结果表明，AHLs主要通过作用于生长素途径来抑制叶柄生长[18］．在这项研究中，发现AHLs通过拮抗促生长光敏色素相互作用因子(PIFs)来限制叶柄伸长。具体来说，AHLs抑制pif介导的基因激活，涉及激素介导的生长，如ACS8它参与乙烯的生物合成，NPY1，参与生长素运输，YUC8,SAUR24，从而解释了它们对叶柄生长的负面影响。

大多数关于AHLs的研究都是在持续的白光或LD中进行的。不仅持续的光不是自然生长环境的特征，而且可能有不同的机制调节短期内的生长(SD;8小时光照/16小时黑暗)，与持续光照或LD相比[18］．此外，尚不清楚ahl在一天中是否对基因表达有不同的影响。因此，为了研究这些问题，我们研究了AHLs是如何调节SD下胚轴伸长的，在这种情况下，我们对这个转录因子家族如何影响生长知之甚少。

AHLs抑制SD下胚轴生长

我们研究了AHLs如何在短昼(SD)(8小时光照/16小时黑暗)下调节下胚轴伸长，在这种情况下，我们对该转录因子家族如何影响生长知之甚少。突变体的表型分析SOB3透露,SOB3-D显示SD下胚轴生长减慢，而sob3-6幼苗非常高(图;1)．这些表型表明SOB3和/或其他ahl抑制SD下胚轴的生长，这与已报道的在恒光或长时间下生长的幼苗相似[1，4，5，6，8，18］．

AHLs在SD中以时间点特异性的方式调节许多基因的表达

接下来，为了深入了解AHLs影响SD下胚轴生长的分子机制，我们确定了在两者之间差异表达的核编码基因SOB3-D而且sob3-6．具体来说，我们使用在三个不同时间点收获的幼苗进行RNA-seq:在ZT4(黎明后4小时)和ZT9(黄昏后1小时)收获的5天大的幼苗，以及在黎明收获的6天大的幼苗(ZT24)(图2)。2一个;表的年代1)．ZT4、ZT9和ZT24的三个时间点是根据已知的下胚轴生长调控和PIF活性在SD中的具体选择的。在SD中，下胚轴的生长主要发生在夜间，此时高表达PIF4而且PIF5与最小的翻译后抑制相一致论坛S受光敏色素和其他抑制因子的影响[19，20.，21］．因此，我们选择测试ZT24时间点，以研究AHLs是否可能通过结合和调节的表达来防止在这个时间点的过度生长论坛S和它们的靶基因。另一方面，我们选择了另外两个时间点，因为它们代表了白天(ZT4)或晚上(ZT9)中PIF活动和生长最小的时间。我们推断ahl可能在一个或两个时间点抑制生长，可能是通过抑制论坛转录和/或pif激活基因的表达。

我们RNA-seq数据的EdgeR分析SOB3-D而且sob3-6在ZT4、ZT9和ZT24分别发现了2276个、2560个和1480个差异表达基因。2B, C)，表明SOB3和/或其他AHLs在白天中期和傍晚早期对基因表达的影响可能比在黎明时更大。在这些差异表达的基因中，发现有2,835个基因被AHLs抑制(图。2B) AHLs仅诱导1654例(图;2C).这表明AHLs在SD中可能更多地作为转录抑制因子而不是转录激活因子。此外，大多数基因只在一个时间点被错误调控。在ahl被抑制的基因中，651个在ZT4被抑制，798个在ZT9被抑制，435个在ZT24被抑制，分别占所有被抑制基因的23%，28%和15%(图)。2B).与ahl诱导的基因总体数量少于ahl抑制的基因一致，在所有时间点都有较少的唯一诱导基因:ZT4为452个，ZT9为567个，ZT24为202个(图2)。2C). ZT4和ZT9的唯一诱导基因分别占所有诱导基因的28%和26%，而ZT24仅占13%。有趣的是，在所有三个时间点都有相对较少的基因错误调控，特别是ahl诱导的基因。在诱导基因中，只有4%的基因在所有三个时间点都被错误调控，而在ahl抑制基因中，13%的基因在所有三个时间点都被错误调控(图。2B, C)。总的来说，这些数据表明，大多数ahl调控基因的表达只在一天中的特定时间受到这些转录因子的影响。

AHLs调节的表达论坛s及其靶基因控制SD下胚轴的生长

AHLs抑制生长的至少一种方式是通过减少pif激活基因的表达[18］．因此，我们研究了RNA-seq数据中几个PIF靶基因的表达是如何受到影响的，重点研究了最近一篇综述中强调的PIF激活基因[21］．事实上，我们的转录组数据表明，在sd生长的幼苗中，PIF靶基因一整天都被AHLs抑制(图2)。2B).一些pif激活基因在所有三个时间点都被鉴定为ahl抑制，如YUC8，IAA19，二阿富汗二月(图。2B)，它们都是与生长素途径相关的促生长基因，这些基因之前也被确定为直接受ahl抑制的基因[5，18］．值得注意的是，我们发现除了IAA19这是一种功能相似的pif靶基因IAA29［22，23，24]也在所有三个时间点被ahl抑制(图。2B) pif激活基因PIL1而且PRE1［25，26]也在所有三个时间点的ahl抑制基因中被发现。2B).值得注意的是，PRE1促进下胚轴生长，可能至少部分通过增强PIF蛋白活性[26，27，28，29，30.，31］．其他PIF靶点仅在一两个时间点被ahl抑制。例如，促进生长的基因CDF5［32在ahl抑制的ZT9和ZT24基因中发现，但在ZT4基因中没有发现。2B).此外，一些基因之间的差异调节SOB3-D而且sob3-6在这三个时间点上，在不同时间点上的表达表现出不同的折叠变化，如SAUR22(ZT4处折叠变化最大)，SAUR19(ZT9处褶皱变化最大)，IAA19 (ZT24处褶皱变化最大)，2)．因此，AHLs似乎在一天中对一些pif调控基因的表达有不同的定量影响。

除了发现许多PIF靶标被AHLs抑制外，我们的数据还表明AHLs抑制的表达论坛在SD中。具体地说,PIF4是ahl在ZT4和ZT9的抑制基因之一，而PIF5，7,8只在ZT9被抑制(图;2B).这些数据表明AHLs调节的表达论坛在白天和傍晚的早些时候，但不要在深夜。值得注意的是，这与上一段所述的AHLs对PIF靶基因表达的影响相反，后者似乎持续了一整天。因此，AHLs可能通过降低pif激活基因的表达来抑制SD下胚轴的生长，这可能部分是AHLs抑制pif激活基因表达的下游结果论坛年代。

AHLs抑制油菜素类固醇生物合成基因，并激活生长抑制因子的表达，以调节SD下胚轴的生长

我们的RNA-seq数据还表明，AHLs可能抑制pif下游油菜素类固醇(BR)的生物合成以及BR信号。CPD而且BR6OX2，这两个pif4激活的基因都编码油菜素类固醇生物合成相关的酶[33，34]，在ZT4的ahl抑制基因中发现BR6OX2在ZT24也属于这一组(图。2B)我们进一步发现喜欢CPD，BES1，该基因编码一个参与br介导的下胚轴生长的关键转录因子[35，36]，在ZT4位点被AHLs特异性抑制(图。2B).综上所述，这些数据表明，在SD中，AHLs对下胚轴生长的抑制作用可能部分是由它们抑制BR通路引起的。

除了抑制SD中促进下胚轴生长的基因表达外，我们的RNA-seq数据还表明AHLs激活生长抑制因子的表达。具体来说，Favero等人强调了8种生长抑制因子．评论(21]是我们从RNA-seq实验中鉴定出的ahl诱导基因(图。2C).在这8个基因中，有6个被鉴定为仅在单一时间点上由ahl诱导的。四种生长抑制因子，包括HY5而且BBX22，是ahl在ZT4特异诱导的。值得注意的是，HY5和BBX22蛋白只有在光照下才不会受到cop1介导的降解的影响[37，38]，因此ahl似乎被激活了HY5而且BBX22特别是当它们编码的蛋白质能够促进下胚轴生长抑制时，即在白天[39，40，41］．BBX22的近亲，BBX21另一方面，它是我们发现的仅在ZT24上被ahl诱导的两个基因之一;然而，BBX21不太可能在夜晚结束时导致生长抑制，因为它像BBX22一样，在黑暗中以依赖cop1的方式大量降解[41，42］．除了这六种生长抑制因子外，有两种被确定为在两个不同的时间点被ahl诱导:ELF4在ZT4和ZT9和IAA17在ZT4和ZT24。总的来说，我们的RNA-seq数据表明，AHLs不仅通过抑制pif激活的生长促进基因的表达，还通过增加生长抑制因子的表达，特别是在白天，来抑制SD下胚轴的生长。

SOB3结合的变化并不能解释SD中ZT4、ZT9和ZT24基因的差异调控

由于我们的RNA-seq数据显示AHLs在一天中的不同时间调节不同的基因集，我们接下来通过在RNA-seq相同的三个时间点执行ChIP-seq来研究SOB3与DNA的结合是否在SD中全天发生变化。2一个;表的年代3.)．在给定时间点的三个重复中至少有两个被SOB3结合的基因被认为是后续分析的SOB3结合基因(图2)。3.(黄色轮廓线)，结果显示ZT4基因14,718个，ZT9基因14,226个，ZT24基因14,778个。当这些基因相互比较时，我们发现大多数基因在所有三个时间点都与SOB3结合(图3)。4)．有趣的是，有少数基因只在一个或两个时间点结合(图2)。4)．这些观察结果表明，SOB3主要在这三个时间点与相似基因结合。

接下来，我们研究了SOB3结合位点的分布，以评估SOB3在基因组中的功能。我们观察到大多数结合位点都靠近转录起始位点(启动子- tss)(图。5)．此外，SOB3在基因体内的结合事件较少，5%的结合事件发生在外显子，3%发生在内含子。Favero等人同样观察到SOB3主要结合位于基因体外的基因组区域，其中高比例的结合事件发生在启动子- tss区域[18］．有趣的是，在这五个类别中，每个时间点都有相同的绑定事件百分比。在启动子- tss区域在所有三个时间点观察到的高比例结合事件进一步支持了先前的发现，即SOB3作为转录因子发挥作用[1，4，6，14，16，17，43，44，45，46，47，48，49，50，51]，并进一步表明SOB3的这种作用在一天中保持一致。此外，当比较三个时间点的结合模式时，我们观察到SOB3在所有三个时间点的结合几乎相同(图2)。6)，这表明这种转录因子在一天中很大程度上与相似的位点结合。因此，AHLs对ZT4、ZT9和ZT24基因表达的不同影响不太可能是通过与靶基因结合的改变来解释的。

与tcp和pif相关的基序在SOB3 ChIP-seq数据中高度丰富

然后我们利用MEME-ChIP对ChIP-seq数据进行motif富集分析[52］．该分析显示了类似于tcp结合序列的GGHCCA基序[53，54，55，56]，在所有时间点的所有重复中都是最丰富的motif(图。7)．在每个重复和每个时间点，该motif也比所有其他motif丰富得多，这表明在SD中ahl和tcp之间存在密切的关系。Favero等人最近的一篇论文研究了SOB3在长时间内对叶柄生长的影响，GGHCCA motif也被认为是最丰富的motif [18］．正如他们在论文中所指出的那样，这个主题可能是这个数据集中最丰富的，因为tcp和ahl已经被证明具有物理相互作用[6，53，54，57］．因此，该基序可能与SOB3蛋白- dna复合物中的tcp结合。我们的模因芯片分析也揭示了其他类型的基元在所有三个时间点上的富集(图。7)．其中一个基序是carpg，它类似于由pif结合的序列[25，26，54，56，58，59，60］．考虑到我们从RNA-seq数据中发现的几个pif激活基因的表达被ahl抑制，这是特别有趣的。因此，AHLs很可能直接结合到PIF靶标的启动子上，并调节其在SD中的表达，这似乎也发生在叶柄生长的背景下[18］．各种at丰富的主题也在所有三个时间点排名很高。其中一些，包括AWATAAWA、AWAATAW、TATWTWW、ATAWWATA和TATTWTW，只含有腺嘌呤和胸腺嘧啶残基，并且与已在体外被证明可与其他ahl结合的motif相似，包括AHL12、AHL20和AHL25 [4，6，14，16，17，51，54，56］．这些基序可能与SOB3本身和/或与SOB3复合物中发现的其他AHL家族成员结合。值得注意的是，ARAGAVA或ARASAVA motif也出现在所有时间点的所有重复中，并且可能与ahl结合，因为它们也富含at。然而，这种可能性似乎不太可能，因为从结构的角度来看，似乎需要四个连续的a /T碱基对来适应AT-hook的结合[61］．

GO项富集显示AHLs在ZT4和ZT9直接诱导相关基因，但在ZT24不诱导

接下来，为了识别AHLs直接调控的基因，我们比较了RNA-seq和ChIP-seq结果。我们在ZT4位点鉴定出1042个被AHLs直接抑制的基因，在ZT9位点鉴定出1183个基因，在ZT24位点鉴定出771个基因。有趣的是，我们发现AHLs直接诱导的基因较少，在ZT4有595个，在ZT9有604个，在ZT24有301个(图4)。8)．因此，AHLs在SD中可能同时扮演转录抑制因子和激活因子的角色。然而，ahl似乎也倾向于充当抑制因子，这与我们之前仅根据RNA-seq数据推断的结果一致。值得注意的是，AHLs作为转录抑制因子的这种偏向似乎在ZT24中特别高。比较各时间点sob3结合的ahl调控基因，我们发现其中64%在ZT4位点被抑制，66%在ZT9位点被抑制，72%在ZT24位点被抑制。8)．

为了进一步研究基于时间点的AHLs直接调控基因的差异，我们比较了我们鉴定为AHLs直接靶点的基因在不同时间点的GO术语富集情况。在直接被ahl抑制的基因中，富集最多的GO项主要包括那些参与外部环境反应的基因，以及随后的内部反应(图2)。9)．“对内源性刺激的反应”、“对有机物的反应”、“对刺激的反应”和“对激素刺激的反应”等术语在所有时间点上都是最受抑制的GO术语。然而，当ZT24与ZT4和ZT9进行比较时，有一些显著的差异。例如，“催化活性”在ZT24的直接抑制基因中是第二高的GO项，但在ZT4中要低得多，在ZT9中也不在前25名之内。还有其他有趣的时间点特定的发现，在GO方面的抑制基因，如“响应生长素刺激”，它在ZT4和ZT24高度富集，但在ZT9不富集。此外，“对油菜素类固醇刺激的反应”，“蛋白质磷酸化氨基酸结合”和“磷酸化蛋白结合在ZT4高度富集。相比之下，“光收获复合物”和“叶绿素结合”都在ZT9上高度富集。AHLs在ZT4和ZT9时间点直接诱导的基因中，排名靠前的是“叶绿体部分”、“质体部分”或“质体部分”和“叶绿体”，但在ZT24时间点，排名靠前的GO术语完全不同，包括“转录因子活性”、“转录调节活性”和“对激素刺激的反应”。此外，与ZT24位点直接诱导基因相关的与叶绿体功能无关的顶级功能，大多是此时点直接抑制靶标中也高度富集的功能。综合这些数据，在不同的时间点，ahl似乎有一些特定的过程被调节，但与ZT24相比，ZT4和ZT9有更多的相似之处。

SOB3与靶基因结合的变化并不能解释AHLs在ZT4、ZT9和ZT24基因调控的差异

最后，我们回到SOB3在ZT4、ZT9和ZT24位点结合的差异是否可以解释AHLs对基因表达的时间点特异性影响的问题。首先，我们检查了从RNA-seq数据中识别出的ahl调控基因是否以及在哪个时间点识别出来，并在图中特别突出显示。2B和2C与SOB3结合。根据我们的ChIP-seq数据，我们发现几乎所有这些基因在所有三个时间点都与SOB3结合(表S4)．重要的是，基因如CPD，BES1，HY5,BBX22在ZT4、ZT9和ZT24位点与SOB3结合，尽管它们只在三个时间点中的一个受到AHL的调控(图S1)．这些数据表明AHLs对靶基因的时间点特异性调控并不是通过转录因子结合的差异来实现的。为了进一步验证这一假设，我们检查了SOB3特异性地与被鉴定为ahl抑制的基因的结合分布。10)或ahl诱导(图;11)，只有一两个时间点。使用这种方法，我们再次观察到SOB3在所有三个时间点的相似绑定配置文件。最后，我们研究了目标基因上SOB3富集水平的变化是否可以解释AHLs对基因表达的时间点特异性效应(图S2和S3.)．然而，我们没有观察到SOB3在三个时间点之间的富集变化，这可能解释了AHLs对靶基因表达的时间点特异性影响。这进一步表明，AHLs对基因表达的特定时间效应不是由这些转录因子与其靶基因结合的差异引起的。

AHLs在整个SD中调节生长以及特定基因的表达

SOB3和其他ahl已被证明参与连续白光和LD下光介导的下胚轴发育[1，4，5，6，8，10］．首先，我们在这里证明了SOB3也能够影响SD下胚轴的生长(图2)。1)，与先前报道的AHL22相同[4］．接下来，我们在三个不同的时间点(ZT4, ZT9和ZT24)进行RNA-seq，以确定可能参与下胚轴生长和发育的错误调控基因(图2)。2)．通过测试整个SD的三个不同时间点，我们希望发现仅测试一个时间点就可能忽略的基因调控错误。事实上，我们的数据表明，AHLs在白天中期和傍晚早期对基因表达的影响比在夜晚结束时更大(图2)。2B, C)，尽管有可能只是在ZT24的幼苗中表达的基因比ZT4和ZT9少。此外，我们发现大多数基因只在一个时间点被错误调控。这些数据表明，ahl调控基因在一天中的特定时间受到很大程度的影响。

ahl分子调节进行通信和pif靶基因，包括新发现的Pre1 pil1 hfr1，CDF5,而且XTR7， SD格式

为了更多地了解SOB3和其他ahl可能对生长产生的具体影响，我们将重点放在论坛s和pif靶基因。我们发现已知的生长促进基因被PIFs激活并参与生长素生物合成(YUC8, (62])或信号(阿富汗二月年代19/22, (25，26，63，64),而国际宇航科学院年代19/29,［22，23，24])在所有时间点都被ahl抑制(图。2B).另一方面，论坛S本身(4，5，7,8),BES1，参与BR信号传递[35]只在一个或两个时间点被抑制(图;2B).值得注意的是，已知BES1和PIF4在激活生长促进基因表达的复合物中共同起作用[26，34]，我们的数据表明，AHLs通过抑制两者的表达来降低该复合物的活性，特别是在ZT4BES1而且PIF4(图;2B).此外，我们还鉴定了pif调控的BR生物合成基因CPD而且BR6OX2［33，34]在ZT4处被直接抑制(图;2B、表S4)，表明AHLs可能通过减少BR的生物合成进一步降低了BES1- pif4复合物的活性，从而减少了活性BES1的数量。

除了CPD而且BR6OX2，我们还确定了5个PIF靶基因被抑制，以前没有被描述为被ahl抑制:Pre1 pil1 hfr1，CDF5,而且XTR7(无花果。2B)。PRE1而且PIL1在所有时间点都被压抑。PRE1促进PIF-和br介导的细胞伸长调控[26，27，28，29，30.，31］．另一方面，PIL1，最近更名为PIF2 [65]，是一个以非典型方式工作的PIF。在负反馈回路中，PIL1抑制其他PIF家族成员基因表达的激活，从而抑制生长[66，67，68］．相比之下PRE1而且PIL1，HFR1仅在ZT9处被抑制(图;2B)．HFR1也抑制pif介导的基因表达和生长的激活，作为负反馈循环的一部分[69，70，71，72］．CDF5而且XTR7在ZT9和ZT24位点均被SOB3抑制，但在ZT4位点未被SOB3抑制。2B). CDF5促进一些pif激活基因的表达，包括YUC8而且IAA19，并始终对下胚轴的生长起积极作用[32］．XTR7(也称为XTH15)是一种细胞壁修饰酶，已被证明能积极调节叶柄伸长[73］．鉴于调节下胚轴和叶柄生长的分子机制有许多相似之处[21]，可能XTR7也促进下胚轴伸长;因此，AHLs对SD下胚轴生长的影响可能部分是由于其抑制作用所致XTR7．

此外，微管已被证明参与了拟南芥下胚轴的伸长[74，75］．事实上，在我们的RNA-seq数据中发现几个编码微管相关蛋白(MAPs)的基因被SOB3抑制。例如,MAP65-6，其蛋白质定位于线粒体并结合微管[76]在ZT4和ZT9被抑制，并在所有时间点被SOB3结合。微管稳定基因，WDL4［77，78]， ZT9抑制，SOB3在各时间点结合。事实上，最近人们发现WDL4通过调节根尖钩形成过程中的PIN运输来调节生长素最大值[79］．因此，我们的数据表明，SOB3可以通过抑制SD下胚轴伸长部分控制地图年代。

我们的RNA-seq数据还表明，AHLs激活SD中生长抑制因子的表达。我们特别鉴定了Favero等人讨论过的生长抑制因子。21，例如HY5, BBX21-22，ELF4,而且IAA17，为ahl诱导(图;2C).然而，有趣的是，Favero et al. [18]观察到较高的表达BIN2在SOB3-D相比sob3-6使用在LD生长并在ZT4收获的14天大的植物，我们没有发现BIN2两种突变体在ZT4、ZT9或ZT24位点被差异调控。因此，虽然AHLs可能通过促进bin2介导的磷酸化以及随后PIF3和PIF4的降解来抑制生长[80，81通过加强…的表达BIN2在幼莲座中[18]， AHLs可能不会通过这一途径抑制幼苗的生长，至少那些在SD中生长的幼苗。考虑到我们和Favero等人。18研究确定RGA由于在SOB3-D相比sob3-6在ZT4(图;2C)， AHLs可能部分通过促进della介导的PIF降解和抑制PIF与靶基因结合来抑制SD下胚轴生长[82，83，84，特别是在这个时间点。

一个重要的问题是，PIF靶基因是否真的像我们的ChIP-seq数据和Favero等人的数据所表明的那样，由AHLs直接调控。[18)的研究。可以想象，PIF指标的下调是在SOB3-D相比sob3-6可能仅仅是PIF活性降低的下游结果SOB3-D，鉴于我们发现PIF4，5，7,8都受到ahl的抑制(图;2B)和AHLs可能促进della介导的PIFs降解，如上所述。然而，虽然这些机制可能会降低PIF活性，从而降低PIF靶基因在ZT4和ZT9上的激活，但它们似乎不能解释AHLs对这些基因在ZT24上表达的负面影响。AHLs理论上影响ZT24中PIF活性的另一种方式是增加、转录，从而增强了phyB介导的这些转录因子在夜间的降解，因为phyB在黄昏后才慢慢恢复到其不活跃的Pr形式[85，86，87，88，89，90，91，92］．然而，在我们的RNA-seq数据中，唯一被发现有差异调节的光受体是UVR8。因此，至少在SD的ZT24中，AHLs可能直接抑制PIF靶基因的表达。

SOB3:一种转录因子和潜在的染色质重塑蛋白

在我们的数据中看到的SOB3结合模式可能表明SOB3是一种染色质重塑蛋白。AT-hook motif首次在高迁移率组(HMG)蛋白中被描述[93，94，95]，是一个非组蛋白染色体蛋白质家族，在多种真核生物中都有发现[96，97］．与SOB3类似，HMGA蛋白含有一个AT-hook基序，通过该基序结合AT-rich DNA [95，98，99］．此外，HMGA蛋白也参与染色质的组织[97]和enhancesome的形成[One hundred.，101］．HMGA蛋白与组蛋白H1竞争与连接体DNA的结合，导致染色质结构松动[95，102，103，104］．此外，HMGA蛋白已被证明与H2A/H2B/H3/H4核小体结合[105]，表明这些蛋白在转录调节过程中对核心组蛋白的驱逐和/或动员作用[95］．HMGA蛋白也可能参与DNA环和染色质重排，将增强体/启动子聚集在一起，从而开始转录[95，One hundred.，101］．我们的SOB3 ChIP-seq结合数据可能表明SOB3的作用类似于HMGA蛋白，其作用是通过修饰染色质被动地调节转录。SOB3也有可能作为转录因子或染色质重塑蛋白，这取决于结合发生的特定环境。

SOB3本身可能不是染色质重塑因子，而是通过其他机制影响染色质重塑，例如与染色质重塑复合物的成员相互作用。这些复合物在进化上是保守的，包含多个亚基。染色质重塑复合物可以通过改变核小体的组成来调节染色质结构[106，107］．目前已知的染色质重塑atp酶有四个主要亚家族:INO80/SWR1、CHD、ISWI和SWI/SNF [108，109，110，111，112，113，114］．SWR1将组蛋白H2A交换为H2A. z。这是特别有趣的，因为温暖的温度促进H2A的排出。从染色质中提取Z，增强了pif靶向基因的激活，如YUC8［18，62，115，116，117，118，119］．此外，有一些证据表明SOB3抑制转录YUC9通过增加H2A来招聘。通过招募SWR1复合物在其启动子上沉积Z [8］．有趣的是，肌动蛋白相关蛋白9 (ARP9)已被证明参与SWI/SNF染色质重塑[120，121]，在我们的RNA-seq数据中发现，在所有时间点都是诱导的。需要进一步的实验来确定SOB3是否通过与染色质重塑复合物相互作用或影响染色质重塑蛋白的表达来影响染色质重塑。

AHLs在植物发育中的作用:农业意义

先前的研究表明过度表达SOB3而且AHL20拟南芥和亚麻荠延缓开花[9，10］．进一步研究新发现的sob3调控基因，如CDF5，可能阐明了SOB3调节花期的其他机制。例如，丧失功能cdf5-1与野生型植物相比，突变体开花时间更早[122］．改变或调节作物物种开花时间的能力有许多宝贵的优势，例如允许不同或增加种植季节。进一步的实验评估的作用CDF5在ahl调控的花期可能阐明操纵这一有利农艺性状的附加机制。

总之，我们的数据显示，在sd生长的幼苗中，在三个不同的时间点，参与下胚轴生长的基因被抑制，而生长抑制因子被AHLs诱导(图2)。2)．此外，我们发现尽管AHLs在不同时间点调控的基因组略有不同，但SOB3的结合模式在很大程度上保持一致(图2)。4，5，6，10,11)．重要的是要注意，我们不能排除在基因表达的一些差异之间观察到的可能性SOB3-D而且sob3-6在我们的RNA-seq实验中，两种基因型之间下胚轴长度的表型差异是间接引起的，因此在本实验中使用的时间点不受AHLs的直接调控。然而，我们怀疑至少在本实验中鉴定的ahl对基因表达的某些时间点特异性影响可归因于含有ahl的蛋白复合物在ZT4、ZT9和ZT24的组成不同。AHL复合物的活性可能是通过与不同的非AHL转录因子相互作用而改变的，这些转录因子对调节基因表达和最终下胚轴在SD中特定时间点的生长很重要。或者，AHL复合物中特定AHL家族成员在不同时间点的变化可能解释了这些转录因子在三个时间点对基因表达的不同影响。AHLs也有可能通过作为染色质重塑蛋白调控SD中的基因表达，因为AT-hook motif也在染色质重塑HMGA蛋白中被发现。或者，在SD中ahl本身并不是染色质重塑者，它们可能参与染色质重塑复合物的成员来调节基因表达。未来的研究应重点验证这些假设，以阐明SOB3和其他ahl调控基因表达和下胚轴生长的精确分子机制。

本研究的目的是揭示在SD条件下促进拟南芥在不同时间点生长的独特分子事件。更准确地说，我们的目标是识别与SOB3结合并在两者之间被错误调控的特定基因sob3可能参与拟南芥下胚轴生长发育的突变体。总体设计包含两个主要实验:ChIP-seq和RNA-seq，下面将详细描述。

植物材料和生长条件

拟南芥(拟南芥研究中使用的系都在Columbia (Col-0)背景中，之前已经描述过:SOB3-D而且sob3-6［1];ProSOB3: SOB3-GFP sob3-4［5］．种子表面消毒，在含0.6% Gelzan CM (Sigma-Aldrich)和1%蔗糖(w/v)的全强度MS培养基上生长。种子在4°C黑暗中分层3天。植物在MLR-351植物生长室中生长。在22°C的温度和短日光周期(8小时亮/16小时暗)下保持5 - 6天。白天使用3LS作为光照设置，产生的白光荧光灯的通量率约为35 ~ 55 μmol/m²/秒。在RNA-seq和ChIP-seq实验中，幼苗在黎明后4小时(ZT4)、熄灯后1小时(ZT9)或第二天黎明时(ZT24)三个时间点之一收获，并立即在液氮中冷冻。

拟南芥基因座标识:

• PIF4: AT2G43010

• CPD: AT5G05690

• BES1: AT1G19350

• SAUR24: AT5G18080

• BR6OX2: AT3G30180

• PRE1: AT5G39860

• SAUR19: AT5G18010

• SAUR22: AT5G18050

• YUC8: AT4G28720

• PIL1: AT2G46970

• IAA19: AT3G15540

• IAA29: AT4G32280

• HRF1: AT1G02340

• PIF5: AT3G59060

• PIF7: AT5G61270

• PIF8: AT4G00050

• CDF5: AT1G69570

• XTR7: AT4G14130

• ELF4: AT2G40080

• HY5: AT5G11260

• BBX22: AT1G78600

• RGA: AT2G01570

• PRR9: AT2G46790

• IAA17: AT1G04250

• ELF3: AT2G25930

• BBX21: AT1G75540

下胚轴的测量

苗木用于定量sob3在上述相同的条件下培养突变表型。野生型种子为拟南芥(l)Col-0生态型。5天大的种子被转移到透明体中，用平板扫描仪对其进行数字化处理。这些透明度包括一个用于测量1毫米长度的尺子，以设置ImageJ (NIH)中测量的参数。用分段线仪从下胚轴顶部到根部开始测量下胚轴。测量结果被转移到Excel电子表格中进行分析。采用双尾韦尔奇t检验检验突变体和野生型下胚轴长度是否存在显著差异。

RNA测序(RNA-seq)和数据分析

在指定的时间点收获20-35株完整的幼苗，在不同的培养皿上生长不同的生物重复。同一生物复制组中不同基因型的样本从同一培养皿中收获。这种实验设计是为了尽量减少板间变异对基因表达的影响。根据制造商的说明，使用RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)提取总RNA，包括柱上DNase消化以消除基因组DNA。分离出的RNA使用KAPA链RNA- seq试剂盒(KAPA Biosystems)进行文库制备，使用NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (New England Biolabs)作为接头，使用Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter)珠而不是KAPA Pure珠。使用Illumina NextSeq500测序仪获得84或86 bp的单读序列。原始数据文件(bcl格式)通过bcl2fastq (Illumina)转换为fastq文件。利用Bowtie方法将50%以上的reads定位到拟南芥TAIR10 cDNA参考位点。123使用以下参数:' -all -best -strata '。每个样本映射的总reads数为600 - 1200万。使用R/Bioconductor的edgeR包识别成对样品之间差异表达的转录本[124]而FDR的临界值为0.05。ahl调控基因被定义为至少有一个转录本在sob3-6和sob3- 3之间有差异调控的核编码基因。维恩图是使用在线工具生成的http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/．

染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)

ChIP程序包括每个时间点3个生物重复。ChIP-seq的染色质免疫沉淀基本上如前所述[18］．1.5克ProSOB3: SOB3-GFP sob3-4［5整个幼苗在ZT4收获，立即用液氮冷冻。使用MB1200多珠震荡器(Yasui Kikai)将样品研磨成细粉末，在1%甲醛中交联10分钟，之后分离核部分。染色质悬浮在SDS裂解缓冲(50毫米Tris-HCl (pH值7.8),1% SDS, 10毫米EDTA)与芯片稀释大约5倍稀释缓冲(50毫米Tris-HCl pH值7.8,0.167 M氯化钠,特里同x - 100 1.1%, 0.11%钠脱氧胆酸盐,1罗氏完整EDTA-free平板/ 50毫升溶液),在十二5°C 15分钟使用Covaris S2 Focused-ultrasonicator milliTUBE 1毫升阿发纤维管(Covaris)和以下设置:责任周期5%,强度4,周期每200年破灭。这产生的平均碎片大小约为100-300 bp。超声染色质在4℃下使用抗gfp抗体(ab290, Abcam)和Dynabeads蛋白A(赛默飞世尔科学公司)进行免疫沉淀。用抗体孵卵后，用低盐RIPA缓冲液(50mMTris-HCl [pH 7.8]， 150mMNaCl, 1mMEDTA, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 0.1%脱氧胆酸钠，1个Roche cOmplete Ultra片/50 mL溶液)洗涤1次，用高盐RIPA缓冲液(50mMTris-HCl [pH 7.8]， 500mMNaCl, 1mMEDTA, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 0.1%脱氧胆酸钠，1个Roche cOmplete Ultra片/50 mL溶液)洗涤2次，用LNDET (10mm Tris-HCl [pH 7.8]， 250 mM LiCl, 1% IGEPAL CA-630清洗1次，1%脱氧胆酸钠，1mm EDTA)和一次TE缓冲液。染色质从Dynabeads中洗脱，并在含有10 mM Tris-HCl [pH 7.8]， 300 mM NaCl, 5 mM EDTA和0.5% SDS的溶液中在65°C交联。采用苯酚-氯仿萃取-乙醇沉淀法分离DNA。测序库基本上按照Rymen等人的描述制备．(2019)。使用Qubit dsDNA HS测定试剂盒和Qubit 2.0荧光计(赛默飞世尔科学公司)对分离的DNA进行定量，并对3.65 ng ChIPed或输入(用于对照文库)DNA进行文库制备。使用KAPA Hyper Prep Kit for Illumina (KAPA Biosystems)和Illumina兼容适配器(New England Biolabs)制备文库。使用Illumina NextSeq500测序仪获得86 bp的单读序列。

染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)数据分析

原始数据文件(bcl格式)通过bcl2fastq (Illumina)转换为fastq文件。超过70%的reads使用Bowtie方法唯一映射到拟南芥TAIR10参考文献[123，设置为“-m”。“每个样本的唯一映射reads总数为1100万到2600万。通过使用MACS2中的" callpeak "命令将ChIP样本与输入进行比较来调用峰[125］．折叠富集bdg格式峰值文件是通过使用处理堆积生成的，控制lambda输出文件由“callpeak”生成，作为MACS2“bdgcmp”命令的输入，设置为“-m FE”。然后，这些折叠富集bdg文件被转换为bigWig文件，bigWig文件又被用于在deepTools中分别通过computeMatrix和plotHeatmap或plotProfile命令生成显示SOB3结合分布或靶基因相对结合的图形[126］．使用整合基因组学查看器(IGV) 2.3.88版本对峰值进行可视化[127，128］．Motif分析采用模因芯片[129]拟南芥PBM基序被选为已知基序[56］．以SOB3-GFP ChIP-seq峰峰为中心的300 bp核苷酸序列作为主要输入序列进行MEME-ChIP分析。山峰用HOMER标注[130］．维恩图是使用在线工具生成的http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/．

量化和统计分析

在指示的地方，在哪里进行了双尾韦尔奇t检验P≤0.05 = *;P≤0.005 = **;P≤0.0005 = ***;而且P≤0.00005 = ****

通过BINGO进行基因本体富集分析[131］．使用MeV 4.8.1查看GO学期结果并创建热图[132］．

在当前研究中生成和/或分析的数据集可在基因表达综合库中获得，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE189265．

我们感谢Doi纪子的技术支持和杉本实验室成员的有益评论和讨论。

这项工作得到了美国国家科学基金会项目#1656265(给M.M.N.)，美国农业部国家食品和农业研究所，Hatch Umbrella项目#1015621(给M.M.N.)，以及日本科学促进协会(JSPS)研究员#19F19781(给D.S.F.)的资助。C.N.J.和D.S.F.都得到了jsp奖学金的支持。

作者指出

1. 凯特琳·n·雅克和大卫·s·法维罗对这项工作同样做出了贡献。

作者及隶属关系

1. 理研可持续资源科学中心，日本神奈川横滨230-0045

   凯特琳·n·雅克，大卫·s·法维罗，河村绫子和杉本惠子

2. 华盛顿州立大学作物与土壤科学系，美国华盛顿州普尔曼99164

   凯特琳·n·雅克和迈克尔·m·内夫

3. 分子植物科学研究生项目，华盛顿州立大学，普尔曼，华盛顿州，99164，美国

   凯特琳·n·雅克和迈克尔·m·内夫

4. 日本中部大学生物科学与生物技术学院生物化学系，爱知县嘉须井，487-8501

   Takamasa铃木

5. 东京大学生物科学系，东京，119-0033，日本

   Keiko杉本学

贡献

C.N.J.和D.S.F.进行了大部分实验，分析了数据，创建了图表，并撰写了手稿。A.K.进行RNA提取，并为RNA-seq和ChIP-seq样品制备文库。T.S.对全基因组数据集进行了测序和初步分析。K.S.和M.M.N.与C.N.J.和D.S.F.一起构思了这项研究，并提供了监督，并对论文的写作和修改做出了重大贡献。所有作者都审阅了手稿。

相应的作者

对应到David S. Favero或迈克尔·m·内夫．

伦理批准并同意参与

这些实验没有使用濒危或受保护物种。SOB3-D而且sob3-6突变体(1]和ProSOB3: SOB3-GFP sob3-4线(5]是之前在内夫实验室生成的，并被送到杉本实验室，在那里，实验是根据适当的机构和国家关于转基因植物材料使用的指导方针进行的。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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