质体结构为8Calanthe兰科s.l.l种:比较基因组学，系统发育分析

背景

Calanthe(Epidendroideae，兰科)是分布在亚洲和非洲的泛热带属。其种类具有重要的经济、观赏和药用价值。然而，由于有限的和混乱的界定字符，分类Calanthe联盟(Calanthe，Cephalantheropsis,Phaius)尚未得到充分解决。此外，有限的基因组信息显示其系统和系统发育不一致。在本研究中，我们使用illumina平台测序，进行了a新创装配，并做了对比分析Calanthe类群种质体:6Calanthe和2Phaius物种。系统发育分析重建了该种的亲缘关系以及与兰科其他种的亲缘关系。

结果

完整的质粒Calanthe群种具有四分结构，大小在150,105bp-158,714bp之间，包括一个大的单拷贝区(LSC);83,364bp- 87,450bp)，一个小的单拷贝区(SSC;16,297bp -18,586bp)和一对反向重复区(IRs;25,222bp - 26,430bp)。这些质体的总GC含量在36.6 ~ 36.9%之间。这些质体编码131-134个差异基因，其中蛋白质编码基因85-88个，tRNA基因37-38个，rRNA基因8个。对比分析表明，它们的序列、基因含量、基因顺序、序列重复数和GC含量均无显著差异，具有高度的保守性。然而，一些基因在C。成为（p .成为),包括ndhC，ndhF,ndhK基因。与编码区相比，非编码区具有更多的序列重复，因此对物种DNA条形码具有重要意义。系统发育分析揭示了该品种的副系关系Calanthe组，并确认了位置Phaius成为属的Calanthe与之前的位置相反Phaius。

结论

本研究报告了6种植物的完整质体Calanthe和2Phaius并阐明了质体的结构特征。它还强调了质体体数据在解决系统发育关系和澄清密切相关物种之间的分类学争议方面的力量，以提高我们对它们的系统学和进化的理解。为研究兰科植物的进化关系和群体遗传学提供了宝贵的遗传资源和基础。

Calanthe是蚁科中最大的属;兰科)，有220多种[1]，分布在亚洲热带和亚热带、澳大利亚、马达加斯加、非洲、中美洲和南美洲以及加勒比地区[2，3.，4]。Calanthe种是常绿或落叶植物，陆生(很少生或附生)，有粗根，小椭圆形假球茎，高度脊状的叶，直立，偶尔拱起的花茎[5]。它们的花长在基生叶上，颜色艳丽，有白色、黄色或粉红色，开口朝上，从小、中到大不等。6]。它们在受损或衰老后经常变成深蓝色。7]。Calanthe是第一个被人类人工用于杂交目的的兰花品种[8]。它的种类有许多观赏和药用价值，是维多利亚时代流行的观赏室内植物[9]。在中国传统医学和印度阿育吠陀等传统医学体系中，Calanthe具有多种用途，包括解毒降温、解硬块、活血化瘀、治疗关节炎、风湿、溃疡、普通感冒、外伤等。此外，一些品种被用作补药和壮阳药[10，11]。

Calanthe自1821年建立以来，经历了许多世纪的一系列属内分类修订[12]。1914年，Schlechter首次将该属细分为两个亚属和不同的部分，大多数作者在随后的研究中都观察到了这种亚属分类[13]。亚属Preptanthe(Rchb.f)。Schltr。以肿胀的假球茎和一年生叶为特征，而亚属Calanthe缺少突出的假球茎，有常绿的叶子。的Calanthe群是附生兰亚科Collabieae族中一个定义明确的兰花群，经鉴定包括属Calanther . Br。，CephalantheropsisGuillaumin,Phaius不悦之色。［14]。这三个属已被证明有密切的关系，因此导致划界的挑战，特别是在该属Calanthe和Phaius。一般来说，这一组的物种的特征是:折叠的叶子，简单，广泛展开的萼片和花瓣，融合的唇基部和柱，和八个蜡质花粉[6]。形态,Cephalantheropsis其特点是无刺唇瓣，脱离柱体，花粉直接生长在球形粘质上，而Phaius唇瓣有一距，在柱基部生长但缺乏贴毛具柱翅具花粉由短尾柄附着。另一方面，Calanthe其特征是唇瓣贴生于柱状翅膀，形成管状和受鞭毛的基部，花粉由明显或不明显的尾状花序束缚，附着在粘质上[15]。然而，唇部与骨柱的结合已经被证明独立地进化了好几次，而一些物种，比如Phaius成为(Finet) P.J.Cribb & Perner，在这两种状态之间有一个中间列类型，因此分类不一致[16]。

在分子研究方面，兰科植物一般有两种分类体系(即Dressler 1993和Chase et al. (1994)) [17，18，19，20.，21]，试图推断其系统发育和从属到亚科水平的进化。附着物亚科内，三属;Calanthe，Cephalantheropsis和Phaius，形成一个独立的联盟，被称为Calanthe联盟，可以很容易地与亚科内的其他分类群区分开来[1，4，15]。然而，在系统发育关系和亲缘关系Calanthe联盟问题仍未解决。以往对附枝科的分子研究处理了两个传统的系Calanthe,即:PreptantheRchb。f和StyloglossumBreda，作为不同的属[3.，5]。此外，其他的分子研究Calanthe小组报告说Calanthe一个多系属是否与其近亲聚集在一起Cephalantheropsis和Phaius,形成了一个独立的联盟，在附着物科(兰科)中被命名为Calanthe联盟(3.，15，16］。这个联盟可以从科内的其他分类类群中区分出来，基于重叠的叶子，相似的萼片和花瓣，基部和侧面的花序，具自由萼片和花瓣的复生花，有刺的唇，和八个蜡质花粉形成两个类群[15]。然而，确定这个联盟的系统发育和分类关系是困难的。这是由于在精确的划界特征的不确定性和分子系统发育不一致Calanthe联盟，这导致了较差的分类分类;因此，在系统发育和分类关系Calanthe联盟仍然没有定论。为了更好地了解它们的系统发育关系，我们有必要确定主要进化支的遗传信息差异Calanthe联盟。

属Phaius含有约40种已知物种，其中9种分布在中国[6，21]。这一属的种还具有唇瓣长在柱体基部，有一棱，但与柱体翅膀不相连，花粉通常由短尾柄附着[15]。根据形态资料，本属可分为两种类型:苞片早落或宿存[6]。Calanthe另一方面，其特征是唇瓣与柱状翅膀相适应，形成管状和有刺的基部，授粉具有明显或不明显的尾状花序，通常附着在粘性的粘质上[6，14，21]。以前，属Calanthe和Phaius分别以唇部贴附于或几乎脱离柱来区分，但所有中间条件都存在[22]。然而，对这些物种的遗传研究有限，而且上述特征是模糊的，因此不足以区分属或下属分类群Calanthe联盟。因此，需要更深入的研究来解决这些关系。

系统系统学和系统发育学自成立以来，通过基因组分析促进了被子植物之间进化关系的分类和解释[23]。叶绿体在光合作用中是必不可少的，与细胞核和线粒体一起构成初级遗传系统的一部分[24]。在许多被子植物中，质体(叶绿体基因组)的大小从120到170 kb不等[25]。质体在基因大小、基因含量、基因排列和基因组结构等方面相对保守[26]。与核基因组相比，叶绿体基因组很少发生核苷酸替换和基因重排;因此已经成为研究复杂陆生植物遗传变化和系统发育的完美模型[27]。

在本研究中，我们对该属8个种的叶绿体全基因组进行了测序、组装和注释Calanthe联盟,即:Calanthe和Phaius。这项研究的目的是;1)。了解质体内的遗传结构和变异;2)。2 .识别和描述cp基因组结构、序列差异、突变热点区和重复区在质体中的特征;评价属间的系统发育关系Calanthe和Phaius，这可能对进一步的物种进化研究有用。

叶绿体基因组组织Calanthe组的物种

研究了8种植物的叶绿体全基因组Calanthe组显示一个共同的四部结构，由两个倒置重复(IR)区域(IRa和IRb)，一个大单拷贝(LSC)区域和一个小单拷贝(SSC)区域组成。它们的大小范围如下:IRs (25,222bp-26,430bp)， LSC (83,364bp-87,450bp)和SSC (16,297bp-18,586bp)(图2)。1;表格1)。

GC含量在LSC、SSC和IR区域内变化较大，分别在34.2-34.6%、29.4-29.8%和43.0-43.1%之间(表1)1)。

大部分基因组编码134个差异基因，包含88个CDS和38个tRNA。然而，仅记录了131和133个基因，85和88个cd, 38和37个tRNA基因p .成为和p . flavus,分别。所有这些物种都编码了8个rRNA基因。8Calanthe群质体除了丢失的三个基因外，它们的数量、顺序和名称都是相同的p .成为,即ndhC，ndhF,ndhK。此外，Calanthe组质体含6个tRNA基因(trnA-UGC，trnI-GAU，trnG-UCC，trnK-UUU，trnL-UAA和trnV-UAC)和九个蛋白质编码基因(rpl2，rpl16，rps16，rpoC1，ndhA，ndhB，atpF，petB和petD)含有一个内含子和三个基因(ycf3，clpP,rps12)，含有两个内含子。在IR区域共有19个基因被复制，包括3种基因，即7个编码基因(rps12，rps19，rps7，rpl2，rpl23，ndhB，ycf2)， 8个tRNA (trnH-GUG，trnI-CAU，trnL-CAA，trnV-GAC，trnI-GAU，trnA-UGC，trnR-ACG，trnN-GUU)基因和四个rRNA (rrn16，rrn23，rrn4.5，rrn5)基因(表2)。的rps12基因被反式拼接，在cp基因组中重叠两个区域，其中5 '端外显子位于LSC区域，而内含子3 '端外显子位于IR区域。此外，三对基因，trnK-UUU/matK，atpE/atpB,psbD/psbC有重叠的序列。

红外区域的收缩和扩张

8个物种的叶绿体基因组结构和IR区域之间的连接位置在LSC/IRb、IRb/SSC、SSC/IRa和IRa/LSC边界上表现出几种结构差异(图2)。2)。在LSC/IRb边界观察到三种不同的情况。首先,在Calanthe ecarinata和c . tricarinata,rpl22该基因位于距IRb区22bp的LSC区。其次，在5种中，即:c . brevicornu，c·阿尔，p . flavus，p .成为和c·培,rpl22基因在LSC/IRb区有52 ~ 60bp的重叠。第三个事件发生在c . taibaishanensis即rps19基因距离LSC/IRb 24bp，而不是rpl22。7个物种的IRb/SSC连接区相对保守ndhF基因在IRb区交叉了51 ~ 70bp，但在p .成为由于它ndhF基因的损失。在这方面，最接近的基因trnN在IRb中，距离SSC区域367bpp .成为。SSC/IRa和IRa/LSC在8个基因中均有较好的保守性Calanthe对基因组进行分组ycf1基因越过42-1035 bp的SSC/IRa边界进入IRa区段。此外，在7个物种的IRa/LSC连接处psbA该基因位于LSC区域，距离IRa 106-154 bp。的IRa/LSC结c . taibaishanensis区别在于rps19基因发生在离LSC 25 bp的IRa中。

比较基因组分析

基于mvista的同一性图揭示了八个质体的DNA序列和基因同源性守恒，并显示了遗传变异增加的区域(图2)。3.)。基因的数量、顺序和取向相对保守。不同的序列变异记录在几个基因区域，包括psbA-trnK-UUU，rps16-trnQ-UUG，matK-trnK-UUU-rps16，trnS-GCU-trnG-海湾合作委员会，rpoB-trnC-GCA，petN-psbM，psbM-trnD-GUC，trnE-UUC-trnT-GGU，trnT-GGU-psbD，ndhK-trnM-标出，atpB-rbcL，rbcL-accD，accD-psaI，petA-psbJ，psbE-petL，trnV-GAC-rps12，ccsA-ndhD，trnL-UAA，trnL-高斯，ndhF，ndhI，rps15，trnP-UGG，rpl33，clpP，psbT，rpl16，rpl14，rps8和rpl32。LSC和SSC区域的遗传变异性高于IR区域，非编码区域的遗传变异性高于保守蛋白编码区域。rRNA基因高度保守，在质体之间的数量几乎没有变化。此外，IGS区域比基因区域的变异更大。

滑动窗口分析确定了8个高度可变的区域Calanthe将具有核苷酸多样性的质体分组(π)截止点设于π≥0.03(无花果。4)。与IR区相比，高变异区域主要出现在LSC和SSC区，非编码区比编码区多。高度可变的区域被确定如下:trnS-GCU-trnG-GCC，rpoB-trnC-GCA，trnE-UCC-trnT-GGU，rpl32-trnL-UAG，ccsA-ndhD和psbL，clpP和rpl32叶绿体基因组的基因。这些发现与mVISTA的结果一致，即叶绿体基因组IR区域的变异相对低于LSC和SSC部分。

序列重复

本研究共记录了507个SSRs, 8个物种的叶绿体基因组中SSRs的数量几乎相同(57-76)(图2)。5)。Calanthe阿尔简单重复次数最多(76次)，而Phaius成为SSRs最少(57)。此外，从单核苷酸SSRs到三核苷酸SSRs，重复基序的碱基组成存在碱基偏好，主要是富含a - t的重复基序。单核苷酸重复序列是8个cp基因组中最丰富的SSRs(28-45)，而六核苷酸重复序列最少(1-2)4)。A/T重复序列是最多的单核苷酸重复序列(287个)，其次是以AT/AT重复序列为主的二核苷酸重复序列(92个)，三核苷酸重复序列均为AAT/ATT。重复序列最少的是AAG/CTT、AAATAT/ATATTT、AAGTAT/ACTTAT、ACATAT/ATATGT和AGATAT/ATATCT(表5)4)。8个全基因组的LSC中ssr数量最多(385个)。单核苷酸重复最丰富，范围为18-33 (LSC)， 8-10 (SSC)和(1-2)IR。六核苷酸是所有区域中ssr最少的，在所有物种的ir中都没有出现(图2)。6，7，8，表54)。

检测到串联重复序列，并将其分类为正向(F)、回文(P)、反向(R)或补体(C)，每个重复序列长度≥30 bp，序列相似性≥90%。共鉴定出28 ~ 40个重复序列，重复次数最多的是p .成为(无花果。9)。其中，回文重复最多Calanthe群质体(17-25)，而补体重复最不丰富(1-5)。叶绿体基因组中未发现补体重复序列c·阿尔和p . flavus。检测到的重复序列长度主要在31 ~ 50bp之间。此外，在长度为51 - 70bp的8个cp基因组中均未发现补体重复序列(图2)。10和表S5)。总体而言，ssr和串联重复序列在8Calanthe组cp基因组无显著差异(Kruskal-Wallis;P< 0.05;表的年代6)。然而，在cp基因组的不同结构和功能区域，ssr和串联重复序列的数量、类型和大小差异很大，这些重复序列在非编码区比在编码区丰富(表5)3.)。

密码子的使用

8种植物叶绿体基因组的RSCUCalanthe使用所有蛋白编码基因计算组种，共记录密码子50,035-52,904个。每个物种的RSCU值在蛋白编码基因的64个密码子中显示出相同的密码子偏好。在这方面，从30、31、32和33个密码子Calanthe taibaishanensis;c·阿尔，c . brevicornu，Phaius成为，Phaius flavus,Calanthe ecarinata;c . tricarinata;和c·培其中色氨酸(Trp)和蛋氨酸(Met)在所有种属中均不表现出偏好(RSCU = 1)。其余密码子为最不优选(RSCU < 1)。8个cp基因组的CDS基因中未发现RSCU < 0.1的罕见密码子Calanthe集团(无花果。11)。

由UUA、UUG、CUU、CUC、CUA和CUG编码的亮氨酸(Leucine, Leu)含量最多，占密码子总数的4993 ~ 5374个，比例为9.70 ~ 10.56%。由UCU、UCC、UCA、UCG、AGU和AGC编码的丝氨酸(Ser)是第二丰富的氨基酸，编码比例为8.93- 9.81%(4661 - 5187个密码子)，而由UGG编码的色氨酸(Trp)是最不丰富的氨基酸，编码比例为1.22- 1.47%(641-759个密码子)(表5)7)。统计分析8个地区的RSCU值Calanthe组cp基因组差异不显著(Kruska-Wallis，P< 0.05;表的年代8)。

系统发育分析

高通量测序技术的应用提高了整个质体基因组的可用性，从而可以利用质体组序列来分辨密切相关的类群[24]。8个新序列的系统发育位置Calanthe和Phaius物种推断使用64,593个字符(核苷酸)的矩阵。这些特征代表了该物种共有的73个蛋白质编码基因Calanthe类群中，合并有14种Calanthe为此，他们的完整叶绿体基因组序列已正式在NCBI数据库中公布。ML树和BI树具有相似的系统发育拓扑结构，具有较高的自举值和后验概率(图2)。12;图年代1)。Phaius物种(不含p .成为)在系统发育树上形成两个分支(图2)。12;图年代1)。第一个进化支包括p . tankervilleae,p . hainanensis(英国石油公司_(毫升)= 100%， pp = 1.00]。第二支由只p . flavus(英国石油公司_(毫升)=75.6/57%， PP =0.9851]，与Cephalantheropsis,和Styloglossum。第三支由两个姊妹群组成:Cephalantheropsis（c . obcordata),Styloglossum（c . lyroglossa)[英国石油公司_(毫升)= 100%， pp = 1.00]。第四支由两个物种组成，p .成为/c成为(英国石油公司_(毫升)= 100%， PP = 1.00]，而最后一支系由该剖面的其余种组成Calanthe。所有种类的教派。Calanthe聚集在一起形成一个超级进化枝[BP]_(毫升)= 100%， PP = 1.00]，由三个谱系组成，包括14个Calanthe组的物种。第一个谱系只包括c·阿尔(英国石油公司_(毫升)= 98.2/95%， PP = 1.00]，该分类群是包含该剖面其余种的一个分支的姊妹。其余的种类形成了这一节的另外两个谱系，包括(c . triplicata，c . sylvatica，c . davidii)及(c . taibaishanensis，c·培，c . arcuata)[英国石油公司_(毫升)= 98.9/96%， PP = 1.00]和(c . grifithii，c . tricarinata，c . ecarinata，c . brevicornu)及(c .苦丁，c .二色的和c . aristulifera)[英国石油公司_(毫升)= 100%， pp = 1.00]。

8种植物叶绿体基因组的比较Calanthe组的物种

完整的叶绿体测序和基因组分析表明，兰花质体在大小、结构、基因顺序和含量方面高度保守。28，29，30.，31]。这些研究结果与我们对水稻8个质粒的研究结果一致Calanthe研究小组发现，8Calanthe群种是一种四部结构，其大小在150,105 bp (p .成为)及158,714 bp (c·培)。质体分为四个区域，包括LSC (83,364bp-87,450bp)， IRs (25,222bp-26,430bp)和SSC (16,297-18,586bp)。推断出的结构和内容与以往对兰花的研究一致[32，33]。被子植物叶绿体基因组具有保守的基因组结构[34]，包括两个反向重复序列(IRs)，它们将一个大的单拷贝区段(LSC)和一个小的单拷贝区段(SSC)分开。此外，与细胞核和某些植物线粒体基因组相比，叶绿体基因组更小，更不容易重组，为研究基因组大小变化和进化状态提供了独特的数据[35，36]。这些特征对比较研究很有用，因为它们使研究人员能够调查从早期陆生植物[37]到最近驯化的植物，并探测基因组大小进化的选择信号[38]。

8个基因组的大小Calanthe群种的大小在150,105 bp (p .成为)及158,714 bp (c·培)。前人对种子植物的研究提出了导致叶绿体基因组大小变异的三个重要因素:(1)基因间区域变异，主要影响属内叶绿体基因组大小的变异[39，40];(2)红外区域的变化[41，42];(3)基因丢失，这是一些植物叶绿体基因组缩小的重要原因[41，42]。这个长度相当于大多数被子植物cp基因组的大小范围[43]。然而，兰花中cp基因组的大小差异与这两个反向重复区域的收缩和扩张有关[4，28，44］。

尽管被子植物的质体在大小范围上存在差异，但它们在基因含量上的差异相对较小[45]，这与我们的研究结果相似，该研究显示了8种动物基因顺序和排列的序列相似性Calanthe质体系。质体的特征和序列变异与物种的系统发育关系和进化有关;因此，近亲物种更可能具有相似的质体大小和特征[46]。先前对开花植物质体结构进化的研究表明，转座因子增殖的累积影响远远超过串联或分散基因重复对增加基因组DNA含量的影响，以及基因组长期分离的过程，这与全基因组重复后大多数基因重复的丢失有关[47]。转座因子被认为是基因调控和适应的重要因素，特别是因为基因含量在植物间相当一致，并且转座因子积累和降解迅速[48，49，50]。虽然这种模式现在已经知道了，但尽管兰科植物的多样化速度很快，但相关兰花属基因含量恒定的根本原因还远远不够清楚。

此外，在8 .的LSC和SSC区域的GC含量Calanthe与IR区相比，类群物种较少。这种情况可能是由于四种rRNA基因，rrn16，rrn23，rrn4.5,rrn5红外区序列[33]。

8株cp全基因组的蛋白质编码基因有少许差异Calanthe类群物种，尽管陆地植物通常被认为是高度保守的[51]。我们发现蛋白质编码基因ndh家庭差异Calanthe组的物种。的基因ndhC，ndhF,ndhK我们迷失在p .成为但它们在其他物种中被保留了下来。这三种NADH脱氢酶亚基的缺失在兰花中很常见，Chen于2020年首次在该物种中报道[4]。在高等植物中，cp基因组包含11个ndh基因(ndhA-ndhK)，编码烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚基，与核编码亚基结合形成NADH脱氢酶样(NDH)复合物，参与光系统I (PSI)周围的循环电子流和氯呼吸[52，53]。虽然叶绿体NDH复合物介导了PSI中的循环电子传递，但在PSI中没有负面影响ndh-在适当的生长条件下观察到有缺陷的突变体或转基因[29]，表明叶绿体ndh在自养植物中可能不需要基因。显然，质体丢失或假原化ndh在各种光自养种子植物谱系中已经观察到基因[54，55),包括兰花，石斛兰，蝴蝶兰属,Ophrys［29，56，57，58]。这些研究还表明，不同种类的兰花表现出不同的损失或保留的基因;例如,兰花编码ndhE，ndhJ,ndhC基因(59),而金蝶兰属植物只编码ndhB基因(31]。失去了ndh基因与进化过程有关，因此一些研究推断兰花祖先的蛋白质编码ndh基因可能已经转移到细胞核[28，60]。真菌共生体也被认为缺乏功能性ndh基因;因此，来自这些资源的同源基因被认为执行丢失的叶绿体编码的功能ndh一些兰花的基因[32，60]。然而，这一假设还有待检验，其背后的机制的变化损失或保留ndh兰科植物的基因值得进一步研究。

比较分析

DNA条形码技术已广泛应用于物种识别、资源管理以及系统发育和进化研究[61，62]。8 .比较分析Calanthe利用mVISTA进行类群叶绿体基因组分析，揭示了近缘种间DNA序列的相似性。没有明确的重排或基因倒置记录，表明Calanthe群质体高度保守[28]。基因组的大小和基因间间隔的组织与先前观察到的基因大小的变化相对应Calanthe叶绿体基因组[4]。

与其他研究结果一致[63]而mVISTA的数据，LSC和SSC区域比IR区域变化更大。mVISTA结果揭示了8个质体中以下高度可变的区域:psbA-trnK-UUU，rps16-trnQ-UUG，matK-trnK-UUU-rps16，trnS-GCU-trnG-海湾合作委员会，rpoB-trnC-GCA，petN-psbM，psbM-trnD-GUC，trnE-UUC-trnT-GGU，trnT-GGU-psbD，ndhK-trnM-标出，atpB-rbcL，rbcL-accD，accD-psaI，petA-psbJ，psbE-petL，trnV-GAC-rps12，ccsA-ndhD，trnL-UAA，trnL-高斯，ndhF，ndhI，rps15，trnP-UGG，rpl33，clpP，psbT，rpl16，rpl14，rps8和rpl32。有趣的是，这些高度可变的区域大多与其他物种的突变热点相似Calanthe联盟(4]，提示这些变异基因座可作为今后研究中华白蛉的进化和多样性的重要参考Calanthe联盟。与SSC区域相比，LSC和SSC区域的核苷酸多样性更高，并确定了跨区域的以下高变区Calanthe组质体系:trnS-GCU-trnG-GCC，rpoB-trnC-GCA，trnE-UCC-trnT-GGU，rpl32-trnL-UAG，ccsA-ndhD以及蛋白质编码基因psbL，clpP和rpl32。在这些基因和基因间区域中观察到的高度分化与在其他被子植物中观察到的相似[4，64，65]，可能是由于与其他地区相比，由于突变率较高，基因组进化速度较快[66]。

红外区相对于SSC和LSC区是相对保守的Calanthe质体系。仅在LSC/IRb连接处观察到显著差异，在8个物种中出现了3次。同时，其余三个(IRb/SSC、SSC/IRa和IRa/LSC)是保守稳定的。在IR中检测到收缩是由于失去ndhF基因p .成为。之前的研究强调了ndh对兰花IR/SSC边界的不稳定性有显著影响的基因[58，67]。不同植物的大小差异和进化事件也可能与叶绿体质体不同区域连接的扩张和收缩有关[23，68，69]。边界的位置，特别是扩张和收缩的位置，已被成功地用于推断系统发育关系，并为蜜蜂科谱系的进化提供了见解[70]，蕨类植物[71]，豆科[72]，松科[28]，以及许多单子叶植物[73]。然而，尽管整个基因组结构和基因顺序高度保守，兰花质体在IR/SSC边界上表现出明显的差异，这很难用于系统发育研究。此外,ndh在兰花属中，SSC区域的基因已独立丢失[58，67]，证实了Kim等人(2015)的研究结果[30.]，这表明兰花IR/SSC连接的不稳定性与基因的缺失高度相关ndhF基因。尽管如此，兰花质粒两侧IR/SSC连接序列变化的机制仍不清楚。因此，我们目前对红外边界的研究结果并没有提供必要的信息来阐明它们之间的进化关系Calanthe组，因此，额外的抽样Calanthesp .及相关属可进行明确而具体的测试[74]。

分子标记

简单序列重复具有数量多、重复度高、结构简单、叶绿体基因组母系遗传、相对保守等特点，是有效的遗传标记[75]。SSRs和重复序列已广泛用于物种鉴定、系统发育分析、种群进化研究和各种物种的系统地理[76]。在这方面，所有8个基因中SSRs和串联重复序列的数量和分布的变化Calanthe检测了群体基因组和整个质体的不同区域。与编码区相比，重复序列在非编码区分布广泛，这与之前对其他物种的报道一致[30.，77]。叶绿体基因组重排和核苷酸取代可归因于这些重复序列的差异分布[78]。

此外，与SSC和IR区相比，SSRs主要分布在LSC区，这表明SSRs的分布依赖于它们在叶绿体基因组中的位置[79]。因此，这些重复序列可用于开发用于系统发育研究的遗传标记。所鉴定的SSR和串联重复序列也可用于研究该物种的遗传结构、多样性、系统发育和分化Calanthe和其他兰花品种的联盟。

相对同义密码子用法

RSCU值是特定密码子的使用频率与预期频率之比，可以消除氨基酸组成对密码子使用的影响[80]。此外，RSCU促进同义密码子的检测[81]。大多数RSCU值大于1的密码子以A或U结尾，而以C或G结尾的密码子的RSCU值小于1。这些发现与以前的研究一致[82，83]。

组成限制和翻译选择被认为是导致蛋白编码基因在质体内和质体间密码子使用差异的主要因素[84]。此外，在大多数富含AT或gc的生物体中，组成偏倚已被证明决定了基因间密码子使用的差异[85]。对RSCU的分析可以为研究不同物种中同义密码子偏偏好的具体机制提供基础[86]。此外，它在分子生物学基础的实践和理论研究中都起着至关重要的作用[87]。

系统发育和分类学意义

利用叶绿体基因组数据进行系统发育分析已成功地用于推断被子植物之间的进化关系[30.，81，83]。由于质粒序列的缺乏，利用完整质粒对兰科植物进行系统发育研究还处于相当早期的阶段。然而，利用全质体(种树)确定的兰科主要系系之间的关系与利用两个或三个基因(基因树)进行的兰科大规模系统发育研究结果一致。因此，对更多兰科全质粒的测序有助于解决紧迫的系统发育问题。由蛋白质编码基因、非编码区和高变区组成的分子数据集已被用于推断主要兰花分支之间的主要系统发育关系[88]。然而，关于几个亚部落和属的系统发育位置存在许多不确定性。这种知识差距是由于缺乏涵盖所有主要兰花枝(亚部落/属群)所需的分类学和基因组取样工作造成的[89]。在本研究中Calanthe我们的系统发育评估中包含的联盟属与最近的研究基本一致[6，15]，尽管有一些不同之处。

以往的研究Calanthe群根据形态特征(唇对柱的附着)识别Calanthe和Phaius如paraphyletic [21，90，91]。此外,p .成为，以前被包括在属中Phaius基于Pridgeon [14]，后来被归为属的一员Calanthe基于分子证据(ITS和cpDNA)15]。这些发现与我们的研究结果一致，我们将在下一节进一步讨论。

在本研究中，Phaius物种(不含p .成为)形成两个支系。第一个进化支包括Phaius：p . tankervilleae和p . hainanensis而第二个分支只包括一种Phaius：p . flavus。这些结果与翟[15，他们是第一个报告内部分歧的人Phaius(不包括c成为/p .成为基于ITS和cpDNA数据。因此，我们强烈支持翟的研究建议Phaius只局限于包括诸如p . tankervilleae和p . hainanensis。由…组成的分支p . tankervilleae和p . hainanensis其特点是花苞片早落，两组中有8个相互分离的花粉。相比之下，第二个进化枝，包括像p . flavus，具有明显的特征，包括宿存花苞片，花粉分为两类，通过茎状物附着在粘性物质上[21，92]。翟的研究提出了一个新属，Paraphaius，包括由…组成的血统p . flavus。的系统发育位置研究结果p . flavus(英国石油公司_(毫升)=75.6/57%， PP =0.9851]。本种与支系聚在一起Calanthe lyroglossa的花柱舌和Cephalantheropsis obcordata的胼胝体节，支持翟志刚提出的承认分段的建议Paraphaius以包含p . flavus。然而，需要更多的采样来帮助进一步充分解决该物种的系统发育。

目前,Phaius成为已成为一种重要的物种在分类研究Calanthe由于其之间复杂的分类学历史Calanthe和Phaius［1，17]。之前的研究发现Phaius成为作为一个纽带Calanthe和Phaius［16］。它在形态学上与…相同Calanthe由于其相对较小的个体，基生叶，细长的柱，和不明显的假球茎[22]。然而，它具有相似的形态学特征Phaius因为它的长唇瓣包围着它的柱子(图2)。13) [15]。此前，基于形态学特征，Chen在1999年[21]，把这个物种当作是教派。Calanthe，尽管在他们的工作中，2009年的中国植物志项目[91，他们接受了这个物种在分类上的位置Phaius正如Perner和Cribb早先提出的[90]。然而，翟的研究在系统发育关系Calanthe在中国的联盟建议p .成为应保留在Calanthe而不是在内部Phaius。此外，本研究建议新增一节，Alpinocalanthe，以适应这个独特的分类群，因为它的系统发育位置和独特的形态特征，即:小植物，花的宿存苞片;唇瓣贴生于柱翅在基部，一纤细的柱;有点3浅裂的唇瓣，周柱和一盘状唇瓣有三个短有毛的脊。基于使用编码序列的ML和BI树，我们的结果表明p .成为(英国石油公司_(毫升)= 100%， PP = 1.00]，与Calanthe比Phaius，与翟的研究结果一致[15]。在这方面，我们也支持使用这个名称Calanthe成为而不是Phaius成为。

卡兰特教派，卡兰特属中最大的非属群是什么Calanthe，包括全球约140种，其中中国有50种[15，93]。在目前的研究中，一个独立的超级进化支包含了所有的14个Calanthe对该段群种进行了鉴定。结果显示，主要关系与其他研究一致Calanthe部分Calanthe集团(4，5，94]。最大似然(ML)/贝叶斯推理(BI)分析结果表明，该属属属属属属Calanthe形成了一个高支撑力的分支，作为一个副系群[BP]_(毫升)= 100%， pp = 1.00]。

我们的结论，然而，关于段落Calanthe与Chen et al.(2020)最新的研究结果有所不同CalantheS.l.的单一性CalantheS.l.种类[4]。这项严格但在分类学上抽样不足的研究完全区分了白桦属的七个物种Calanthe在它们的系统发育推断中具有较高的自举支持值。本研究与本研究之间的差异很可能是由于所包括的性状和分类群的数量存在很大差异[95]。尽管我们的母体具有丰富的特征，因此不太容易出现由个体基因引起的错误[96]，我们必须强调，我们的分类群采样是高度碎片化的，并且补充了来自样本不足和/或未样本属的质体序列Calanthe联盟可能导致拓扑变化。

基于蛋白质编码基因之间的所有目标共享Calanthe群种，我们的研究上calanthe叶绿体基因组为8个新测序物种提供了有价值的遗传信息，突出了利用叶绿体数据解决近缘种之间系统发育关系的能力，并将为未来兰花系统发育研究提供便利。

综上所述，完整的质体体可以为解决近缘类群之间的进化争议提供相关信息。在本研究中，研究了8种植物的叶绿体全基因组Calanthe对群种进行测序和比较。此外，系统发育关系Calanthe以高支持值或中等支持值解决。本研究鉴定的cp基因组高度分化的基因和区域可作为有效的DNA条形码用于遗传多样性研究和系统发育分析。进一步的兰花叶绿体基因组测序对阐明兰花叶绿体的多样性、物种鉴定、系统发育分析和阐明兰花物种间的进化关系具有重要意义。

样品收集

样品采集许可证由中国四川省林业和草原管理局和中国云南省林业和草原管理局颁发。8号的新鲜叶子Calanthe群种分别采于中国四川和云南两省(表5)1)。胡广万、杨嘉欣、董翔等对采集后的样品进行了正式鉴定，其中Calanthe tricarinata，Calanthe阿尔，Calanthe培，Calanthe taibaishanensis，Calanthe ecarinata，Calanthe brevicornu，Phaius成为,Phaius flavus在提取DNA之前，将其储存在密封袋中，密封袋中含有硅胶。每个物种的标本保存在武汉植物园植物标本馆，并有特定的凭证号(表S)1)。

叶绿体基因组测序与组装

基因组DNA是用改良的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)方法从大约100微克的叶子中提取的。97]。使用Novo基因公司(北京，中国)的Illumina平台进行基因组测序，然后过滤低质量数据和适配器，使用GetOrganelle-1.6.2软件组装干净数据[98),用Calanthe triplicata(NC_024544)作为参考基因组。然后使用绷带软件检查人工校正后组装基因组的最终结果。选出最优结果，然后对这些结果进行人工调整。最后，利用genous Prime 2019.2.1 (https://www.geneious.com)。

基因组注释

使用默认设置的GeSeq在线工具对组装的基因组进行注释[99]，然后使用tRNAscan-SE对tRNAs注释进行确认[One hundred.]。质体基因组注释器(PGA)，一个独立的命令行注释工具，验证了CalantheCp基因组[101]。利用OrganellarGenome DRAW软件绘制cp全基因组基因图谱[102(图。1)。将带注释的叶绿体全基因组提交到GenBank数据库，加入号如下:Calanthe阿尔(OL322023),c . brevicornu(OL348396),c . ecarinata(OL348397),c·培(OL348398),c . taibaishanensis(OL351366),c . tricarinata(OL351367),Phaius成为(OL351368),p . flavus(OL351369)。

基因组比较和序列分化

IRscope [103]用于比较倒置重复区(IR)、小单拷贝区(SSC)和大单拷贝区(LSC)的边界连接。使用Shuffle-LAGAN模式，mVISTA软件[104]用于比较和可视化八个物种的完整叶绿体基因组c·培作为参考。此外，所有的8Calanthe使用MAFFT v7.409对联盟cp基因组序列进行比对[105]。此外，我们进行了滑动窗口分析来评估可变性(π)使用DnaSP v5.10 [106]，窗口长度为600个碱基对，步长为200个碱基对。

重复序列结构和简单重复序列分析

的正向、回文、反转和补语重复的可视化Calanthe使用repter进行群体基因组分析[107]，最小重复长度为30 bp，最大为50 bp，序列一致性不小于90%(汉明距离= 3)。使用MISA (https://webblast.ipk-gatersleben.de/misa/index.php) [108]，最小重复次数如下:单核苷酸SSRs为10次，二核苷酸SSRs为5次，三核苷酸SSRs为4次，四核苷酸SSRs为3次，五核苷酸SSRs为3次，六核苷酸SSRs为3次。

相对同义密码子用法

利用MEGA 7提取组合基因组的所有蛋白编码基因[109]软件，然后用于计算相对同义密码子使用率(RSCU)比率。RSCU值>1表示密码子的使用频率高于预期，而值<1表示密码子的使用频率高于预期。没有优先值的密码子设置为1.00。

系统发育分析

利用从8只瓢虫cp全基因组序列中提取的73个PCGs进行系统发育关系分析Calanthe上面提到的类群，有一个外群，Preptanthe鲁本斯(NC_050869)和13个先前测序的Calanthe联盟从NCBI数据库下载(表5)2)。使用默认参数的MAFFT对22个cp全基因组序列进行多序列比对。使用模型查找程序确定最佳拟合模型[110整合到Phylosuite中。最适合系统发育分析的模型是GTR GTR+G, GTR+I+G，以及在ModelFinder中实现的用于串联比对的设置(rcluster)。采用最大似然(ML)方法，利用集成在Phylosuite中的IQ-Tree进行系统发育重建[111:基于gui的软件，使用python 3.6.7编写。该分析在1000次bootstrap重复中运行。然后使用MrBayes 3.2.6通过贝叶斯推理推断系统发育[112]在GTR+G+F模型下(2个并行运行，10,000,000代，采样频率为1,000代)，其中前25%的采样树被丢弃为老化。剩余的树用于构建多数规则共识树，并为每个分支建立后验概率值。最后，使用FigTree v1.4.4对这些树进行细化和可视化，然后使用AI软件进行合并。

本研究生成的完整叶绿体基因组已提交至NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)， GenBank的登入号码如下;Calanthe阿尔(OL322023),c . brevicornu(OL348396),c . ecarinata(OL348397),c·培(OL348398),c . taibaishanensis(OL351366),c . tricarinata(OL351367),Phaius成为(OL351368),p . flavus(OL351369)。本研究分析的所有其他数据和资料均包含在稿件和补充资料文件中。

:

Adenine-Thymine

英国石油公司:

碱基对

CTAB:

十六烷基三甲基溴化铵

cp:

叶绿体

cpDNA:

叶绿体DNA

背景:

脱氧核糖核酸

基于gui软件:

基于图形用户界面的软件

GC:

Guanine-Cytosine

国税局:

反向重复

LSC:

大型单张副本

MAFFT:

使用快速傅里叶变换的多重对齐

兆:

分子进化遗传分析

对剧中:

微卫星识别工具

ML:

最大似然

门店:

下一代测序

NCBI:

国家生物技术信息中心

PCG:

蛋白质编码基因

RSCU:

相对同义密码子用法

核糖体rna:

核糖体核糖核酸

RNA:

核糖核酸

SSC:

小型单张副本

苏维埃社会主义共和国:

简单序列重复

tRNA:

转移核糖核酸

我们感谢Yusuf Hassan Hamza、Peninah Cheptoo Rono和John Mulinge提出的宝贵建议。

中国科学院国际合作计划项目(151853KYSB20190027)、国家自然科学基金项目(31970211)、国家林业和草原局兰花调查专项项目(2019073008)、中国科学院中非联合研究中心项目(SAJC202101)资助。

作者及单位

1. 中国科学院武汉植物园，中国科学院植物种质改良与特色农业重点实验室，湖北武汉430074

   Consolata Nanjala, Vincent Okelo Wanga, Wyclif Odago, Elizabeth Syowai Mutinda, Emmanuel Nyongesa Waswa, Millicent Akinyi Oulo, Elijah Mbandi Mkala，杨佳欣，董翔，胡广万，王庆峰

2. 中国科学院大学，北京，100049

   Consolata Nanjala, Vincent Okelo Wanga, Wyclif Odago, Elizabeth Syowai Mutinda, Emmanuel Nyongesa Waswa, Millicent Akinyi Oulo, Elijah Mbandi Mkala，杨佳欣，董翔，胡广万，王庆峰

3. 中国科学院中非联合研究中心，湖北武汉430074

   Consolata Nanjala, Vincent Okelo Wanga, Wyclif Odago, Elizabeth Syowai Mutinda, Emmanuel Nyongesa Waswa, Millicent Akinyi Oulo, Elijah Mbandi Mkala，杨佳欣，董翔，胡广万，王庆峰

4. 哥本哈根大学生物系，丹麦哥本哈根

   约西亚Kuja

贡献

G-WH和q - fw -概念化，资金获取，项目管理，监督和资源。CN, VOW, WO, ESM和ENW-正式分析，调查和数据管理。CN写了手稿。所有作者都阅读并批准了手稿的最终版本。

相应的作者

对应到Guang-Wan胡。

伦理批准并同意参与

我们遵守了所有相关的机构、国家和国际准则，并得到了中国科学院武汉植物园的许可。

发表同意书

不适用

相互竞争的利益

作者声明无利益冲突。

出版商的注意

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