玉米生长响应不同芽孢杆菌从盐胁迫下的盐沼区分离的菌株

玉米(玉米)的生长性能由于土壤高盐度而受到阻碍。盐度是干旱和半干旱地区最严重的非生物胁迫之一，它导致作物生长不平衡，影响作物收成。植物利用耐盐细菌作为植物生长促进剂，通过调节一些生化、生理和分子特性来促进生长，减少盐的不利影响。人们对非化学、环保和经济方法的偏好引起了人们对环境的质疑芽孢杆菌作为一个联合组植物生长促进根细菌已知减轻盐胁迫的影响。在目前的研究中，耐盐芽孢杆菌从盐碱地土壤中分离得到菌株，并对其生理、分子和生化特性进行了表征。采用MALDI-TOF MS蛋白组分析方法，对从盐沼高盐田采集的24株细菌进行了蛋白质组学分析蜡样芽胞杆菌，枯草芽孢杆菌，芽孢杆菌atrophaeus,芽孢杆菌thorngiensis。将分离物应用于玉米植株作为生物接种菌，可明显提高玉米植株的生长参数(P< 0.01)。盆栽试验结果表明，菌株74和菌株90对盐的有害影响最小。其作用是提高了火焰原子吸收光度法测定的茎和根的钾钠比和钾钠选择性。因此,蜡样芽胞杆菌分离物74与对照相比，茎部干重(133.89%)、根系干重(237.08%)、茎长(125%)和根系干重(119.44%)增幅最大。我们的研究结果表明，从沼泽地中分离的细菌可能是一种经济而简单的方法，可以提高植物的生长和对高盐度土壤条件的抵抗力。

在伊朗，土壤盐碱化是对农业和牧场生产力的广泛威胁。盐沼是生物多样性极其丰富的栖息地，结构复杂[27]它们在生态地貌演化中起着关键作用[51]。这些地区为各种植物、动物和微生物提供了重要的生态系统，这些生态系统适应了全面的宏观和微观环境[23]。植物和根瘤菌在强胁迫下的共同进化可能为发现嗜盐细菌制剂来应对盐度对植物生长参数的不利影响提供了新的视角。一些嗜盐菌菌株似乎通过提高其除盐效率来促进植物生长[5]。

从盐渍条件下分离出的耐盐植物促生长根瘤菌(PGPR)可作为盐渍土农业的益生菌，是一种很有前途的替代作物增产方法[j]。3.]。正如经常报道的那样，耐盐微生物分离物极大地影响了植物的促生长性状[36，37]。一些节细菌属，芽孢杆菌,假单胞菌例如杆菌、，b . aquimaris，b . arsenicus，B。sporothermodurances，节细菌属sp。，b的仙人掌，枯草芽孢杆菌,p . medicona盐胁迫根际土壤通过吲哚-3-乙酸(IAA)、铁蛋白和赤霉素的产生以及磷的增溶作用显著促进小麦生长[j]。47]。的有益影响无色菌piechaudiiARV8 [36]，Stenotrophomonas rhizophila应变DSM14405T [22]，Azospirillum压力(13]，蜡样芽胞杆菌［25]，Halobacillussp.和芽孢杆菌halodenitrificans［8]，两和荧光假单胞菌［31]，Zhihengliuella halotolerans，葡萄球菌succinus，芽孢杆菌gibsonii，Oceanobacillus oncorhynchi，Halomonassp。Thalassobacillussp。2]，几种耐盐品种红球菌属，Oceanospirillales，Bacillales，放线菌目［28]。Leclercia adecarboxylata［54]对不同受盐影响的植物物种的影响已得到广泛调查和证实。芽孢杆菌，作为应激环境下的主要细菌属，由强大的细胞壁的外部屏蔽提供动力[18]，内孢子形成能力[52]、稳定细胞膜[38]和内部酶系统[26来应对和管理环境危害。

本研究旨在分离和表征从伊朗一个沙漠盐沼的土壤样本中收集的细菌分离物。评估了菌株在盐胁迫下促进玉米生长参数的潜力。

土壤样品

土壤样本是从库姆(经度51)东北部的沙漠沼泽地收集的^o东经14分13分92分，北纬34分^o54’7.20”N)。在10 ~ 20 cm的土壤表面采集8个土壤样品，完全混合在一起，最后;一个土壤样本被转移到实验室。土壤样品在黑暗和室温下干燥至少两天，然后过筛。在干燥过程中，土样通过2毫米的筛子筛选，去除鹅卵石和其他惰性物质，然后保存在一个拉链锁盖中。

细菌隔离

11种培养基，包括营养琼脂(NA)、营养琼脂+ MnSO4 (NA)⁺MnSO4)， LB, Moller Hinton琼脂(MHA)，Acidithiobacillus(APH)培养基，紫红色胆汁乳糖(VRB)琼脂培养基，GYM链霉菌培养基，DPM培养基，Azospirillum培养基和固氮菌培养基。所有培养基在121℃下灭菌20 min，平板在4℃聚乙烯袋中孵育。为分离细菌，取1 g土样悬浮于2 ml无菌生理盐水(0.9% w/v NaCl)中，旋涡1 min。土壤颗粒沉淀后，取100 ul上清液在10范围内进行连续稀释⁻¹-10年⁻⁷。每个稀释浓度配制三份。每个稀释浓度各取10微升，用玻璃涂布器涂于固化培养基表面，30℃无光条件下倒置孵育1-3天。所有仪器在使用前都经过完全消毒，所有稀释程序都在层流洁净台上进行，以达到严格的无菌。在30°C条件下孵育2天后，使用无菌牙签根据菌落的形态特征(颜色、形状(顶部和侧面)和直径)分离菌落。因此，每个分离物的数量以每1 g土壤的菌落形成单位(CFU g)表示⁻¹)。将单个菌落转移并在相同的新鲜培养基上单独划线。每个板重新划线两次，以确保菌株纯度，并在相同的液体培养基上培养，用于冷冻原液制备。在含有25% v/v甘油的液体介质中，在- 70°C下长期保存。

革兰氏染色，氧化酶，过氧化氢酶和KOH睾丸

在MHA上孵育48 h后，采用Bartholomew方法对细菌进行革兰氏染色。6]。不染色KOH法[43用革兰氏染色法对结果进行验证。使用0.5 ml 10%过氧化氢溶液进行过氧化氢酶试验，观察气泡的形成。采用生化氧化酶盘对95株菌株的氧化活性进行了研究。

评估冷、干、盐、热和pH值对细菌生长的影响

分离株(以CFU表示)在黑暗和寒冷、干旱、盐度、热和碱度胁迫下的生长情况进行了评估。Muller Hinton培养基被认为是所有实验的基础生长培养基。对于冷胁迫和热胁迫，分离株分别在15℃和60℃下培养10小时。制备含有100 mM NaCl、25% PEG6000和pH = 10的基础培养基，分别在30℃下培养10 h，以适应盐度、干旱和碱度的胁迫。

MALDI-TOF质谱剖面采集

分离株在MHA上30℃传代培养24 h 2次。然后将约100 μg的菌落直接转移到MALDI靶点。然后在室温下干燥，用1uL基质溶液(10 mg/ml a-cyano-4-hydroxycinnamic acid in 50%乙腈和2.5%三氟乙酸)超载，每次测量进行两个重复。采用Flex Control 3.4软件(Bruker Daltonics，德国)，在Autoflex MALDI-TOF质谱仪上进行质谱分析。有效MALDI-TOF MS得分为2的土壤分离菌无疑属于属/种水平。

细菌鉴定

采用德国Bruker Daltonics公司的BioTyper 3.1软件进行细菌分类。所有鉴定报告的分值如下:不可靠鉴定值<1.7,1.7 ~ 2.0表示可能属鉴定，2.0 ~ 2.3表示安全属鉴定和可能种鉴定;最后，>2.3被认为是极可能的物种鉴定。只记录了属于单个培养(生物和技术重复)的所有质谱的最高分[40]。

分离菌株对玉米生长的影响评价

玉米种子(玉米。Var Kosha)来自Karaj种子和植物改良研究所(Karaj，伊朗);http://www.spii.ir/homepage.aspx?site=DouranPortal&tabid=1&lang=faIR)，在蒸馏水中浸泡24小时，让其发芽。第一次灌溉时，将灭菌后的MHA分别以2种盐度(0和100 mM NaCl)和菌株(CFU 2 × 10)处理^3.)，用作灌溉用水。每个处理包括一个细菌分离物和一个盐度水平。第一次灌溉后，每天用灭菌的纯净水浇灌植物(5ml / d)。试验采用完全随机区组设计，分三个重复进行因子处理。20 d后收获植株，依次记录茎、根长(cm)和茎、根鲜重(mg)。对于干重，样品在50°C下干燥，并在达到稳定重量后测量。计算全干重(mg)、全长(cm)和茎/根。钠和钾的含量按照Sakr等人的描述提取，[32用原子吸收光谱仪(AAS)测定。

统计分析

所有统计分析均采用R软件(3.6.2版)进行。采用单因素方差分析(ANOVA)检验实验的显著性，采用Fisher保护最小显著差异(LSD)检验进行均值分离P< 0.01的包装农业。使用SPSS Statistics for Windows, version 16.0 (SPSS Inc.， Chicago, illinois)进行Pearson相关分析。(美国)，以检查控制/盐度胁迫与土壤分离株相对生长之间的关联水平。聚类分析基于Tomida报告[46]采用CLUSTER(3.0版本)软件，采用Java Treeview (1.1.6r4版本)进行树形成像。根据欧几里得距离和完全链接方法进行分层聚类。

分离、表征和基于MALDI-TOF质谱的鉴定

24株分离株中MHA分离株7株，NA分离株2株，NA分离株3株⁺LB为3个，VRB为2个，AZTO为3个，GYM为4个。除35和120两株分离株外，其余分离株在细胞形态上均呈骑马状，菌落表面光滑平坦。这些菌株有多种颜色，包括奶油色、白色、黄色、橙色、砖红色和红色。表格1表示土壤分离菌在选择性培养基(即MHA、NA、NA)下的生长速率⁺、LB、VRB、AZTO和GYM)。

表格2显示非生物胁迫对细菌生长的影响。因此，在盐度胁迫下，分离株36、105、106、120、121和128的生长等于或大于正常条件。分离株33、35、39、73、74、90、129、130和149在盐胁迫下也有显著生长，但其生长迟缓程度最小。在冷胁迫条件下，只有分离株36的生长高于对照，其余分离株的生长均有所降低。在热胁迫条件下，分离物146的生长速度是对照的1.3倍，而其余样品的生长速度明显下降。在热胁迫条件下，146株菌株的生长速度是对照的1.3倍，其余菌株的生长速度明显下降。在较高的pH值(pH = 10)条件下，菌株89和146在胁迫条件下的生长情况优于正常条件，其余菌株的生长情况均有所下降;然而，与对照相比，分离株90、147和148有可接受的变化。所有菌株在干旱胁迫下均有严重的生长迟缓。

对具有过氧化氢酶、KOH降解和氧化酶能力的细菌分离株进行了分子表征和生化分析。所有24株分离株均显示革兰氏阳性和过氧化氢酶阴性反应。然而，在氧化酶和KOH降解试验中，菌株之间存在差异。在这方面，只有4株菌株显示KOH消化活性(33、36、104和130)，6株菌株不显示氧化酶活性(37、90、121、128、130和147)。表格3.总结了MALDI-TOF法鉴定分离株的结果，结果表明分离株与该菌株亲缘关系密切芽孢杆菌属。在MALDI-TOF中对分离株进行了蛋白分析，结果显示分离株均属于菌株B.cereus，B atrophaeus，B.subtilis,B.thuringiensis。生化试验和革兰氏染色证实了MALDI-TOF的结果。这样，所有的分离株都是圆形的，革兰氏阳性，产生内生孢子;因此，它们也是基于显著特征进行表征的。

对照条件和盐胁迫下分离菌株对玉米植株生长参数的影响

菌株在植物上的应用结果表明，在盐胁迫条件下，接种细菌可显著提高单株产量和生长参数;因此，在自然盐碱地条件下，分离菌株可以减轻盐对玉米植株生长的有害影响。盐胁迫下，分离菌株显著提高了玉米叶片和根系的茎干重、根干重、茎长和根长读数。因此，与未接种的对照相比，细菌评估提高了玉米植株在盐胁迫下的生长参数。

盐度条件下的试验结果表明，不同处理间的茎、根生长差异明显。盐度胁迫下植物与微生物的相互作用具有统计学意义(p< 0.001)。4个生长参数与玉米耐盐性分析相关，并与正常和盐胁迫下玉米植株的茎干重、根干重、茎长和根长有关。表格4论证了土壤分离物在正常条件和盐胁迫下对玉米植株生长的影响。结果表明，菌株33、74、90和130在胁迫条件下比对照显著提高了干重，根长和根重均显著增加。分离株33、74、90、105、130和128在盐胁迫下对玉米根系干重的影响优于对照。此外，128种细菌在盐度和正常条件下对根干重的影响相同。总体而言，分离株73、74、90、105和130在盐胁迫下的玉米植株总重高于正常条件。除维持植物生长外，与对照相比，细菌启动处理在盐胁迫下的植物生长。

菌株74和130在胁迫条件下比对照条件下具有更高的茎长。1A、b)和分离株33、74、130和146对玉米根系长度的影响相同。此外，菌株90和130在胁迫条件下对植株长度(茎+根)的影响也最大。分离物105在茎长方面也更有效，这可能是由于菌株c诱导了生长素的产生芽孢杆菌105年分离。

盐胁迫下，分离菌株35、38、39、104、105、120、121、128、129、147、148和149的茎部干重较对照弱。各菌株对根干重的影响均高于对照。此外，36、37、38、39、104、105、106、128、147、148和149处理的芽长和芽形成抑制均低于+对照。分离物39对根长的影响小于对照(图2)。1c)。

Na⁺和K⁺盐度和正常条件下茎和根的水平

在非盐胁迫和NaCl胁迫下，接种菌株74和90的植株的总生物量均最高(表2)5)。根据结果，Na⁺和K⁺在盐水和非盐水条件下，细菌施用对芽和根中的钠含量均有影响，其中钠含量显著降低⁺与未接种对照相比，叶和根中的含量。在100 mM NaCl处理下，玉米植株茎部和根系Na、K含量的LSD分析结果显示，对照和盐胁迫条件下的Na、K含量差异显著P< 0.001。表格5表示正常胁迫和盐胁迫下玉米根和叶组织中钠离子和钾离子的含量。由图可知，在100 mmol/l NaCl盐度条件下，接种分离物74的玉米植株Na含量最低;所以分离物74的吸盐量更少。此外，叶面和肌瘤的钾水平随着接种这种细菌分离物而增加。

皮尔森相关

研究盐沼分离物对盐胁迫下植物生长影响的努力已经导致胁迫条件下不同微生物行为的表征，这些行为涉及它们在玉米植物耐盐性中的作用。对照植物生长参数与盐胁迫及对照细菌生长的Pearson相关系数(表1)6)和应力(表1)7)条件反映了控制和盐胁迫下茎部干重与其他植物生长参数的显著正相关(表2)6和7)。此外，细菌在盐胁迫下的生长与干旱和寒冷胁迫下的生长有很大的相关性(表1)6和7)以及细菌在高温和pH值胁迫下的生长(表1)6和7)在盐度和控制条件下。

接种24个土壤分离株植物对盐度响应的聚类分析

由钠等增强化学物质引起的非生物胁迫是发生在根际的一种普遍现象。它负责植物中多种生理过程的存在。耐盐菌作为植物生长促进剂天然存在于根际，其应用为促进植物生长和抗盐提供了一种天然途径。

盐度胁迫下存在和不存在分离株的植物生长聚类结果表明，在亲和性方面，生长参数WW, RDW和RL在一组中一起出现，而ShW, ShL和WL在另一组中出现(图2)。2)。根据对植物生长的影响，分离物也分为两大类。第一组在ShL、WL和ShW上的疗效较好，第二组在RW、WW和RL上的疗效较好(图2)。2)。

几种非生物元素可能在调节土壤微生物的多样性中起关键作用，包括那些居住在根际的微生物[34]，而最重要的非生物胁迫之一是高盐浓度。根据之前的报告，全球约有8.31亿公顷的土地面积受到盐的影响[39]。盐度阻碍光合作用，增加光呼吸，从而通过提供营养失衡改变细胞的正常离子稳态，这是由于植物失去控制养分吸收和/或从根到茎的运输的能力，导致离子缺乏[35]。微生物形式的生命可以在很大的盐浓度范围内被发现。此外，这些生物通过利用各种策略来应对高渗胁迫[41减轻盐度，提高植物的效率[9]。在细菌中，属杆菌和假单胞菌是两种最重要和最常见的植物生长促进剂[9，19，21，24，30.]。此外，研究表明，本土沼泽分离株的存在仍然很重要[42]，因为它将为开发基于本地菌株的植物促进剂产品提供一个机会，以抵御非生物胁迫，例如在伊朗非常常见的盐度胁迫。

几份报告表明，显性的序列芽孢杆菌存在于不同土壤中的物种与存在于容易培养的分离物中的物种是不一样的[55]。事实证明，不仅如此杆菌分离物能增加氨基酸和碳水化合物的积累，但也能降低过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等酶的抗氧化活性和电解质渗漏玉米［48]。

根系相关微生物通过提供微生物生态服务、保护土壤免受机械胁迫、保护土壤免受渗透和氧化胁迫以及影响激素稳态等服务，在非生物胁迫下保持土壤湿度和促进植物生长方面发挥着关键作用[j]。11]。

结果表明，盐胁迫条件下，细菌处理显著增加了单株茎、根干重、茎长和根长。接种分离株显著(P< 0.01)增加了植株的茎干重和根干重，这是衡量植株生理稳定性的重要指标。利用土壤微生物来利用盐胁迫的土地是一种有用的方法，可以提供一种快速解决盐胁迫的方法[44]湿地微生物对水、氧、有机/无机基质和其他可用营养物的不同供应表现出不同类型的代谢和适应性反应[4，15]。盐胁迫下分离菌株对玉米生长参数的影响表明，按效力可分为3组:a)对植物生长有利的分离菌株，b)对植物生长不利的分离菌株，c)对植物生长无影响的分离菌株。因此，已经证明，细菌的芽孢杆菌由于其能够消除或减轻盐胁迫的有害影响，调节植物生理特性，促进植物生长，因此被广泛报道为有希望的细菌候选物[14，19，29，49，53，56]。Wang等。[50在盐浓度为300 mM时，辣椒的茎长增加megaterium。

总之，目前的研究结果表明，细菌分离属于芽孢杆菌在盐沼根际中占优势。在盐度胁迫下，29%的菌株对茎重、50%的菌株对根重、16%的菌株对茎长、8%的菌株对根长有显著影响。研究表明，土壤中高浓度的钠和氯会抑制植物体内的营养离子活性，使植物体内的Na/Ca和Na/K比值达到极值，使植物容易受到渗透和特异性离子的伤害，导致营养失调，从而导致产量和品质下降[j]。16，45]。根据我们的研究结果，观察到接种后玉米生长品种增加芽孢杆菌sp通过降低Na/K比值来支持盐胁迫下的生长。因此，我们的研究结果表明，分离菌株74、33和91降低了这一比例，提高了玉米植株的耐盐性。钾在盐胁迫下对水分胁迫的耐受性起着至关重要的作用。它是一种渗透活性化合物，有助于根部吸水[17，20.]。AbdElgawad等人报道，玉米植株在盐胁迫下可以增加酶促和非酶促抗氧化剂，以防止对盐度的有害影响[1]。磷脂酰甘油含量的增加、磷脂酰乙醇胺和亚油酸含量的降低与耐盐性有关玉米［33]。因此，我们得出结论，细菌分离物在某种程度上参与了耐盐性，以帮助植物提高抗氧化剂和脂质。

实际上，盐沼沉积物细菌在盐沼底栖生物食物网途径中的多样性和功能作用方面主要处于一个黑盒子中[12]。因此，我们研究了是否有可能从盐沼中分离出具有耐盐功效的好氧细菌，以及这些细菌是否也能诱导玉米植株耐盐。我们在盐沼上进行了这项研究，因为盐沼的空间生态学已经得到了非常好的理解;所以在盐沼中发现的细菌在很多方面都很重要。例如，从盐沼根际分离出来的细菌在组成方面显示出对植物植被的寄主特异性[7]以及在丰度和异养活性方面[7，10];从而反映了对不同环境压力的适应。本研究的数据证实了这些证据，表明盐沼是一个具有化学和物理梯度的有益的动态生态系统，可以发现具有耐盐功效的好氧细菌，这些细菌可以减轻盐胁迫的有害影响，并诱导植物耐盐。

评估z梅斯具有有益土壤细菌分离株的植物对植物生长及其在盐度等非生物胁迫下的持久性有很大影响。找到实用的方法来分离和表征这种细菌是很重要的。最关键的步骤之一是如何找出隔离这些细菌的正确位置。盐沼的特殊条件可以为耐盐细菌的出现提供独特的环境。许多这些种类的分离物，以及抵抗盐胁迫，可能在周围的生物中产生抗性。本研究的主要挑战是调查分离物对植物生长的影响及其耐盐性。我们的发现表明枯草芽孢杆菌73年,b的仙人掌74年,b . atrophaeus90个是盐沼优良品系，在玉米作物上应用的可行性有待进一步研究分析。

在当前研究中使用和/或分析的数据集可根据通讯作者的合理要求获得。

作者感谢Shahid Beheshti大学生命科学与生物技术学院植物生物学与生物技术系以及比利时鲁汶大学微生物学与免疫学、临床与诊断免疫学系的技术支持人员。

涉及植物的研究伦理

所有作者都证实，对玉米的实验研究和实地研究，包括从Karaj种子和植物改良研究所接收的种子，符合相关的机构、国家和国际准则和立法。此外，方法是根据相关指南和法规进行的。

这项研究没有从公共、商业或非营利部门的任何资助机构获得具体的拨款、资金、设备或供应。

作者及单位

1. Shahid Beheshti大学生命科学与生物技术学院植物科学与生物技术系，伊朗德黑兰

   Maryam Zakavi和Hossein Askari

2. 比利时鲁汶大学微生物学和免疫学，临床和诊断免疫学学系

   穆罕默德Shahrooei

3. Shahrooei博士医学实验室，德黑兰，伊朗

   穆罕默德Shahrooei

贡献

Maryam Zakavi进行了实验并撰写了手稿。Hossein Askari和Mohammad Shahrooei对这个想法深信不疑，并监督了这个项目。所有作者都讨论了结果，并为最终稿件做出了贡献。作者阅读并批准了最后的手稿。

相应的作者

对应到侯赛因民兵。

伦理批准并同意参与

所有作者同意伦理道德并同意参与这篇文章，并声明这篇文章遵循BMC Plant Biology的政策。因此，这些材料是作者自己的原创作品，以前没有在其他地方发表过。这篇论文没有考虑在其他地方发表。所有作者都亲自积极参与了论文的实质性工作，并将对其内容承担公共责任。

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