地塞米松在高糖条件下通过FAK抑制VSMCs的增殖和迁移

背景

高糖状态下通过信号转导途径引起糖尿病血管的一些改变。地塞米松和其他皮质类固醇在免疫事件中具有广泛的生物学效应。在本研究中，基于高糖条件下FAK基因和蛋白的变化，研究地塞米松对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响。

方法和材料

血管平滑肌细胞在DMEM中培养，并用地塞米松(10⁷10米,⁶10 M,⁵M)在高糖条件下24、48小时。MTT法测定细胞活力。采用RT-qPCR和western blotting技术分别检测FAK基因表达量和pFAK蛋白值。用划痕试验评价细胞迁移。

结果

FAK基因表达水平在24和48小时随地塞米松剂量的增加而显著下降。与基因表达水平相比，在24和48小时时，pFAK蛋白值显著下降，且存在时间延迟。

结论

结果表明，地塞米松在高糖条件下对VSMC增殖和迁移的抑制可能与FAK的变化有关。

众所周知，生化和免疫因素，如血浆脂蛋白、细胞因子和一些细胞变化，如内皮和血管平滑肌细胞功能障碍，可能有助于糖尿病个体动脉粥样硬化的发展[1］．此外，高糖状态会导致糖尿病血管的一些结构和功能改变[2］．这些变化形成脂肪纤维斑块(动脉粥样硬化)，并使血管狭窄和其他并发症进展[3.，4］．血管平滑肌细胞(VSMCs)是参与这些斑块重塑的最重要的血管细胞[5，6］．据报道，FAM3B能够增加VSMC在高糖环境下的增殖和迁移[7］．另一项研究表明，在高糖条件下，Bcl-2、Bcl-xL和Bfl-1/A1等抗凋亡蛋白上调并抑制VSMC凋亡[8，9］．一些蛋白如FAK (Focal Adhesion Kinase)也被报道参与VSMC的增殖和迁移事件。它通过一些整合素和生长因子相关的信号通路被磷酸化[10，11］．

此外，地塞米松和其他糖皮质激素在免疫事件、糖尿病黄斑水肿和脉络膜厚度方面具有广泛的生物学效应[12，13，14］．此外，用于动脉粥样硬化治疗最广泛使用的糖皮质激素是地塞米松[15，16］．有研究表明，地塞米松对血小板生长因子诱导的VSMC迁移的抑制作用也通过调节PGC-1a介导[17］．

在本研究中，我们通过搜索KEGG (https://www.genome.jp/kegg)，因此我们认为FAK是与感染无关的代谢途径中的关键基因。然而，未磷酸化的FAK能够与一些蛋白质相互作用，但其信号转导是通过与其他信号通路的交叉对话进行的，其基础是上游酶的磷酸化或与膜受体相互作用后的自磷酸化(图1)。1)．由于VSMC迁移和增殖事件主要与动脉粥样硬化过程有关，因此本研究研究地塞米松对高糖条件下血管平滑肌细胞FAK基因表达水平和pFAK值、增殖和迁移的影响。

细胞培养

血管平滑肌细胞(NCBI Code, C591)购自伊朗德黑兰巴斯德研究所。细胞在Dulbecco改良鹰培养基(DMEM, Cat。不。BI 1004, Bioidea公司，伊朗)10%胎牛血清(FBS, Cat。编号11560506,Gibco, USA)和1%的青霉素-链霉素(Cat。不。BI1203, Bioidea公司，伊朗)然后，细胞组(70%的一致性)包括对照组正常，对照组高糖(25 mM) [5和地塞米松(10⁷10米,⁶10 M,⁵M) +高糖(25 mM)处理24、48 h。

细胞生存能力

MTT (Methyl Thiazol Tetrazolium, Sigma-Aldrich, USA)方法用来评估VSMC的活力。在96孔板中，每孔4000个细胞播种，用不同剂量的地塞米松培养24、48 h。然后去除培养基，用MTT溶液在37℃下孵育4 h。不。M5655, 0.5 mg/ml, Sigma-Aldrich, USA)。收集MTT溶液后，200 l\ \ upmu \ ()加入二甲基亚砜(DMSO)溶解生成的晶体，在室温下摇15分钟，最后在570 nm波长下测定光密度。

FAK基因表达

GeneAll-Hybrid-R RNA纯化试剂盒(Cat。No. 305-101, Seoul, South Korea)用于从VSMCs中提取总RNA。按照SMOBIO试剂盒(台湾新竹)的说明书进行cDNA合成。为了进行实时RT-PCR反应，丹麦Amplicon公司的SYBR Green PCR Master Mix (Cat。不。使用A190303, Amplicon Denmark)。GAPDH基因被用来规范基因表达水平。所有基因的反应在15µl的体积内进行。在95ºC (10 s)和60ºC (45 s)下进行温度循环(45循环)。为了设计基因引物，Primer-BLAST (NCBI.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)和OligoCalc服务器(http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html)是利用。FAK基因引物序列为Forward;5 ' - CATGCCCTCAACCAGGGATT -3 '，反向;5 ' - CACGCTGTCCGAAGTACAGT -3 '和GAPDH，前进;5 -CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3,反向;5“-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3”。

西方墨点法

提取总蛋白，RIPA缓冲液(Cat。不。sc-24948, Santa Cruz Biotechnology, USA)，其中含有蛋白酶抑制剂(蛋白酶抑制剂鸡尾酒和苯甲基磺酰氟(PMSF))，将其加入细胞板，然后在13000 g(4℃，20分钟)下离心。用Lowry法(Cat。不。美国σTP0200-1KT)。在90 V条件下，15µl的蛋白质样品电泳于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(12%)上。然后将蛋白带转移到PVDF(聚偏二氟乙烯)膜(Cat。不。IPVH00010, Merck Millipore, Darmstadt, Germany)浸泡60分钟(90 V)。PVDF膜用4%脱脂牛奶(脱脂干牛奶，细胞信号技术，USA)阻塞60分钟，然后用FAK抗体(1:1000 V / V，细胞信号技术，Beverly, MA, USA, Cat)孵育。 No. 3283 s) overnight at 4 °C. The PVDF membrane was then washed in tris-buffered saline containing 0.1 percent tween ® 20 (TBST) and was incubated with a secondary antibody (1:10,000 v/v, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA, Cat. No. 7074 s) for 60 min at room temperature. Finally, the membrane was subjected to enhanced chemiluminescence (ECL) reagent (Cat. No. RPN2235, Amersham Biosciences, Italy). The protein values were normalized using beta-actin (1:1000 v/v, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA, Cat. No. 4967 s). Image-J was used to identify the band densities.

划痕试验

用划痕试验评价细胞迁移。vsmc在12孔板中培养，然后用移液管尖端刮除。用PBS (Cat。不。BCBS2233V, Sigma-Aldrich, Germany)，细胞在含有地塞米松的培养基中培养(10⁷,10⁶, 10⁵使用倒置显微镜(OPTIKA，意大利)获得损伤区域图像。使用Image J软件进行图像分析。

统计分析

Graphpad Prism(8.0.3版本)用于分析数据。最初，Kolmogorov-Simonov检验用于评估数据分布。然后用ANOVA检验比较细胞组之间的结果。2^−ΔΔCT用公式识别基因表达的变化。p< 0.05为显著性。

地塞米松降低vsmc的生存能力

用不同浓度的地塞米松处理血管平滑肌细胞后，测定细胞存活率。与对照组相比，在24和48 h后，地塞米松治疗VSMCs显著减少了细胞存活和增殖，且呈剂量依赖性。2)．

地塞米松降低FAK基因表达水平

目前的研究发现，地塞米松与对照组高糖组相比，治疗24和48 h后，血管平滑肌细胞中FAK基因的表达减少(图1)。3.)．

地塞米松降低了pFAK蛋白值

pFAK蛋白值在10⁵24 h后使用地塞米松治疗。4A和B)。另一方面，在地塞米松治疗48 h后，pFAK蛋白值显著下降，值为10⁶和10⁵(无花果。4A和C)。

地塞米松可减少VSMCs的细胞迁移

血管平滑肌细胞迁移率的研究表明，地塞米松(10⁶和10⁵M)显著减少了24 h内的迁移(图。5A和B)。此外，在所有三种浓度的地塞米松中都观察到细胞迁移的显著下降(10⁷,10⁶和10⁵M)后48小时(图。5A和C)。

根据几项研究，高血糖是糖尿病的一种旁临床特征，与动脉粥样硬化中的VSMCs增殖和迁移有关。高糖条件促进VSMC增殖，这部分是由hg激活的STAT3/ pam -1信号介导的[18］．另一项研究发现，FAM3B通过抑制miR-322-5p来调节VSMC的增殖和迁移，以应对高糖诱导[7］．动脉粥样硬化是一种众所周知的血管壁炎症性疾病，被认为是心血管疾病的潜在原因，包括高血压、心肌梗死、中风和外周动脉疾病[19］．许多因素，如炎症、血管生成、高血压、遗传、糖尿病和生活方式都与动脉粥样硬化过程有关[2，20.］．一般认为VSMC的增殖和迁移是动脉粥样硬化进展的重要生物学因素[21，22］．先前的研究表明VSMCs在动脉粥样硬化病变中发挥着多方面的作用，根据具体情况，它们可以改善斑块的稳定性和破裂[23］．此外，研究发现生长因子和细胞因子刺激血管壁中间层VSMCs的增殖和迁移[24，25］．因此，需要更多地了解VSMCs在斑块中的作用，以制定有效的治疗策略来降低心血管风险。

众所周知，与细胞增殖和运动相关的多个信号通路通过FAK的核心蛋白参与[11，26］．fak介导的通路被磷酸化和自磷酸化事件激活，因此pFAK将信号转导到细胞内部更多的部分。特别是整合素- fak通路对细胞迁移的调节，在许多与癌症和其他疾病进展相关的细胞类型中得到了广泛认可[27，28］．众所周知，FAK作为一种变构酶，必须被磷酸化(pFAK)才能将信息传递到通路下游。基于细胞介入研究，FAK活性与总蛋白之间无显著相关性[29］．此外，由于地塞米松的坏死作用，总蛋白库减少。因此，本研究认为FAK的活性形式(pFAK)是触发生物途径的最重要因素，但总FAK可以提供更多的酶活性/失活比数据。

地塞米松具有多种生物学作用，特别是在调节和抑制免疫功能方面。也有研究表明地塞米松可通过多种分子途径影响血管平滑肌细胞的迁移和动脉粥样硬化的发展[12，17，30.］．这些研究报道上调PGC-1α的表达可抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移[17和调节基质金属蛋白酶活性[30.］．在与这些报道一致的情况下，本研究表明地塞米松处理的VSMCs在细胞活力高于60%的值时抑制了细胞增殖和迁移。此外，结果显示，在地塞米松处理的VSMCs中，FAK基因表达和磷酸化蛋白水平下降。由于FAK是介导细胞迁移和增殖过程的许多生物通路中的中心蛋白，因此我们认为，在其他研究中建议的信号通路中添加地塞米松可能抑制VSMCs中FAK诱导的信号通路。

结果表明，地塞米松能抑制VSMCs的细胞增殖和迁移。此外，FAK基因表达和磷酸化蛋白水平降低，因此我们认为，在地塞米松处理的VSMCs中，pak诱导的信号通路可能被抑制。细胞支架的表型变化有待进一步研究。

在当前研究中使用和/或分析的数据集作为补充材料包括在内。

FAK:

粘着斑激酶

VSMCs:

血管平滑肌细胞

心血管疾病:

心血管疾病

用:

地塞米松

HG:

高葡萄糖

DMEM:

杜尔贝科改良鹰培养基

的边后卫:

胎牛血清

PBS:

磷酸盐

互补脱氧核糖核酸:

互补脱氧核糖核酸

麻省理工:

Methylthiazol四唑

PMSF:

Phenylmethylsulfonyl氟化

PVDF:

聚乙二烯二氟化物

TBST:

tris缓冲盐水0.1%吐温®20

发射极耦合逻辑:

增强化学发光

表皮生长因子受体:

表皮生长因子受体

不适用。

目前的研究得到了伊朗医学大学(19363年)的支持。

作者和联系

1. 伊朗医科大学医学院临床生物化学系，伊朗德黑兰

   Ali Akbar Soleimani, Ghasem Ghasempour, Borhan Rahimi Abkenar, Nafiseh Shokri和Mohammad Najafi

2. 伊朗德黑兰Tarbiat Modares大学医学院临床生物化学系

   Asghar穆罕默

3. 伊朗医学大学微生物生物技术研究中心，伊朗德黑兰

   默罕默德·纳杰菲

贡献

M N和AAS设计了该研究。GG、AKS和BR评价基因和蛋白的表达水平。NS、AM和AAS检测细胞活力。所有作者阅读并批准了最终稿件。

相应的作者

对应到默罕默德·纳杰菲．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

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