糖尿病视网膜病变中组织型纤溶酶原激活物和纤溶酶原激活物抑制物-1血清和泪液水平的关系

背景

糖尿病视网膜病变(DR)是长期存在的2型糖尿病(T2DM)的严重并发症，是世界上导致失明和视力残疾的主要原因。本研究的目的是比较DR患者和非DR患者泪液和血清中组织型纤溶酶原激活物(tPA)和纤溶酶原激活物抑制物-1 (PAI-1)的活性。

方法

在本研究纳入的T2DM患者中，26例患者有DR (n= 26)， 29例无DR (n= 29)。采集了所有参与者的血液和眼泪样本。测定血清和泪液中PAI-1和tPA水平。还获得了人体测量、糖化血红蛋白(HbA1c)、肾脏和血脂的数据。

结果

与无DR患者相比，DR患者的病程明显延长，收缩压明显升高。与无DR患者相比，DR患者的血清PAI-1水平明显升高，分别为32.72 (IQR 32.52) ng/mL vs 21.37 (IQR 14.93) ng/mL (p< 0.05)。然而，撕裂PAI-1在两组中具有可比性。两组的血清和泪液tPA水平也具有可比性(p> 0.05)。在DR患者中，眼泪和血清两种生物标志物之间没有显著相关性。无DR患者血清tPA水平与泪液tPA水平呈中度正相关，系数为0.363，但无统计学意义。DR患者泪液PAI-1水平与BMI显著正相关(r = 0.555，p= 0.026)。在无DR组，血清PAI-1水平与尿白蛋白肌酐比值(UACR)呈正相关，具有统计学意义(r = 0.501，p= 0.013)。

结论

本研究显示，与未患DR的患者相比，DR患者的血清PAI-1水平显著升高。因此，泪液生物标志物的作用仍与进一步研究有关。

2型糖尿病(T2DM)是一种新兴的全球流行病，是公共卫生的主要关切。它与许多使人衰弱的宏观和微血管并发症有关。根据国际糖尿病联合会(IDF) 9^th2019年，全球有4.63亿人患有糖尿病，其中1.63亿人在西太平洋地区。粗略估计，到2045年，这一数字将增至2.12亿。[1］．在马来西亚，国家健康发病率调查(NHMS)报告2型糖尿病患病率稳步上升，从1996年的8.3%，到2015年的13.4%，再到2019年的18.3%，这可以转化为近200万18岁以上的成年人[2］．

糖尿病性视网膜病变(DR)是长期且控制不良的2型糖尿病的严重并发症，其范围从轻度疾病到严重的增生性视网膜病变，是导致失明和视力障碍的先兆[3.］．为了便于疾病的筛查和早期发现，已经进行了一些研究来评估泪液蛋白作为生物标志物的可用性。Kim等人报道DR患者的脂脂素-1、热休克蛋白27和β2-巨球蛋白泪液水平逐渐降低[4］．其中一项研究将脂脂素1、乳酸蛋白、溶菌酶C、乳转铁蛋白、嗜脂素A和免疫球蛋白lambda链确定为可能的生物标志物候选物，因为这些蛋白质的水平在DR患者的眼泪中明显更高[5］．DR患者泪液中炎症因子tnf - α水平升高，且与DR严重程度呈正相关[6］．在另一项研究中，泪液蛋白质组学分析和眼底图像上的数字微动脉瘤检测数据被集成为机器学习系统的输入。综上所述，联合模型是一种可靠的筛选方法[7］．

组织型纤溶酶原激活物(t-PA)和纤溶酶原激活物抑制物-1 (PAI-1)也在眼泪中被检测到。PAI-1是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，主要由血管内皮细胞、肝细胞和脂肪细胞分泌。PAI-1是tPA的主要抑制剂，是纤维蛋白溶解过程的主要负调控因子[8］．在糖尿病患者中，PAI-1在大血管疾病中高度表达[9］．值得注意的是，也有研究表明PAI-1表达升高与糖尿病的微血管并发症如肾病和视网膜病变有关[10］．然而，Polat等人报道，伴有或不伴有视网膜病变的I型糖尿病患者血清PAI-1水平无显著差异[11］．tPA是一种将纤溶酶原裂解成纤溶酶的丝氨酸蛋白酶。它在纤维蛋白溶解系统中起着关键作用。血管内皮是血液循环中tPA的主要来源。在糖尿病受试者中检测到较低水平的循环tPA。据报道，长期糖尿病患者纤维蛋白溶解活性降低，进而促进相关的微血栓栓塞。事实上，在糖尿病视网膜病变中，tPA减少与微血管病变导致特征性视网膜缺血之间存在因果关系小1981年[12］．进一步的研究表明，与没有DR的受试者相比，DM伴DR患者血浆PAI-1水平明显更高[13］．根据对T2DM患者的VADT研究，较高的血清PAI-1水平与未来DR风险增加有关[14］．然而，DR患者血浆和眼泪中PAI-1和tPA水平是否存在相关性尚不清楚，因此本研究旨在研究眼泪和血清中PAI-1和tPA水平与DR的相关性。本研究还确定了DR患者和非DR患者血清中PAI-1和tPA水平与其眼泪水平的相关性。

这是一项横断面研究，涉及在马拉理工大学内分泌诊所接受治疗的有或没有DR的2型糖尿病患者。该研究得到了马拉大学研究伦理委员会(REF:600-IRMI(5/1/6))的批准。本研究的样本量使用Open-EPI软件进行比较，使用2个平均公式进行比较，参考Takada等人报道的结果，使用2个平均比较获得95%的置信区间和80%的研究力。[15因此，总样本量(n)为52。在包括15%的损耗率后，总样本量为60。

采用方便抽样的方法招募受试者，纳入标准如下:年龄18岁及以上;T2DM确诊;病程≥5年;HbA1c≤12;过去3个月服用稳定剂量的抗糖尿病药物，估计肾小球滤过率大于60 ml/min/ 1.75 m²．有以下情况的患者被排除:血压> 160/90 mmHg;1型糖尿病;在过去3个月内做过眼部手术;青光眼治疗;视力低于6/12、核硬化III级及以上的后囊膜下白内障);急性疾病或近期因持续感染住院、手术或任何其他导致血糖控制波动的疾病的证据;伴有眼部炎症的严重干涩;服用别嘌呤醇或秋水仙碱的患者和正在接受缺血性心脏病治疗的患者。为排除眼部病变，所有受试者均接受最佳矫正视力、眼压测量、前段裂隙灯生物显微镜检查和Schirmer试验。 Severe dryness is defined as a measurement of less than 5 mm on the filter paper during the Schirmer test. Coloured fundus photographs were taken from the subjects by digital fundud camera (CR-2 AF, Canon Inc, Japan) and were examined according to the Early Treatment Diabetic Retinopathy Study (ETDRS) standards. Based on the outcome of the investigation, subjects were grouped into two categories. Group I was defined as those without DR and Group II with DR.

研究邀请符合纳入和排除标准的患者参与，并获得所有受试者的书面知情同意。一旦受试者同意参加这项研究，他们就被要求去诊所一次，收集双眼泪液、血液和尿液样本。样本在早上8-10点之间采集，以避免目标蛋白水平的日变化[16，17］．

在采集泪液样本时，采用了上文所述的席默泪液试验试纸[6，18］．因此，将胶带的尖端置于下眼睑下结膜穹窿内，并要求参与者保持闭眼5分钟以吸收眼泪。手术过程中要注意不刺激泪液分泌。为了从STT中提取泪液，该条被放置在0.5 ml的管中，管的底部被套管刺穿，并放置在1.5 ml的大管中。然后在4ºC下以16000xg离心5分钟。泪液在离心力的作用下从Schirmer条中抽出，通过穿孔小管的中心“孔”流入1.5 ml的外管。样品保存在-80ºC，直到进一步处理[18］．

在禁食至少8小时后收集10毫升静脉血。血浆在2-8˚C下1000xg离心15分钟，并保持在-80˚C，直到进一步分析，该分析由马拉理工大学医学分子生物技术研究所进行。除了tPA和PAI-1水平外，还检查了血液样本的空腹血糖(FBG)、尿素、肌酐、空腹血脂谱(总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇)、c反应蛋白(CRP)和尿酸。生化测量根据标准的实验室程序进行。FBG采用己糖激酶法，HbA1c采用高效液相色谱法，总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)、尿酸采用酶标法测定。利用Friedwald方程推导低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)。采用颗粒增强浊度法测定CRP。根据实验室方案分析现场尿液样本的尿微量白蛋白，并计算尿白蛋白-肌酐比率(UACR)为白蛋白浓度除以肌酐浓度。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测全血和泪液中PAI-1和tPA浓度。使用人tPA酶联免疫吸附测定试剂盒(目录号:E-EL-H2106 96 T)和人PAI-1酶联免疫吸附测定试剂盒(目录号:E-EL-H2104 96 T)分别检测泪液和血浆中的tPA和PAI-1水平，检测方法参照产品说明书(Elabscience Biotech, China)。 Briefly, for the estimation of both the tPA and PAI-1, 100μL standard or sample was pipetted into the designated wells and incubated for 90 min at 37 °C. Then, 100 μL of biotinylated detection antibody working solution was added to each well and incubation was done for 60 min at 37 °C. Subsequently, the plate was washed 3 times and 100 μL of HRP conjugate working solution was added. After incubation for 30 min at 37 °C, plate was washed again and 90 μL of substrate reagent was added. After further incubation for 15 min at 37 °C, 50 μL of stop solution was added. The absorbance was read immediately at 450 nm using a microplate reader (Victor™ X5, Perkin Elmer).

统计分析

使用SPSS Windows 25.0版本(社会科学统计包，SPSS公司，芝加哥，伊利诺伊州，美国)分析收集的数据。缺失的数据按列表顺序删除。非参数数据以中位数(四分位范围)表示，参数数据以平均值±标准差表示。p值是连续数据的Mann-Whitney检验和分类数据的Fisher精确检验的结果。使用卡方和Fisher精确检验来评估分类变量之间的差异。未配对t连续变量间显著性差异的计算采用检验。

分类变量采用卡方检验，连续变量采用独立t检验。一个p值< 0.05被认为是显著的。在DR患者中，13人患有轻度视网膜病变，11人患有中度视网膜病变，只有3人患有重度视网膜病变。因此，我们无法根据dr的严重程度进一步对样本进行分类。使用非参数数据的Spearmans rho检验分析了两个连续变量之间的相关性。科恩(1988)的分界点被用来解释相关性的强度。因此，r≥0.5为强相关性，而0.3 - 0.5为中等相关性。相关性弱(r < 0.3 - 0.1)，相关性不显著(r < 0.1)。

共55例(女32例，男23例;平均年龄52.37±10.8岁;年龄范围32-72岁)符合纳入和排除标准，并同意参与研究。学科特征见表1．

有DR和无DR患者之间的比较显示，有DR患者的疾病持续时间显著延长，为14.5年(IQR 10)年，而无DR患者为9年(IQR 6)年(p = 0.017)。同样，DR组的收缩压145 (IQR 14) mmHg明显高于无DR组的132 (IQR 23) mmHg (p = 0.022)。(表1）.

DR患者的血清PAI-1水平明显高于无DR患者，中位值分别为32.72 (IQR 32.52) vs 21.37 (IQR 14.93) ng/mL。差异达1.53倍(p< 0.05)。然而，有和没有DR的患者泪液PAI-1水平具有可比性(p> 0.05)2）.

虽然DR组血清tPA水平中位数为3.48 (IQR 5.06) ng/ml低于无DR组3.94 (IQR 6.72) ng/ml，但差异不显著(p< 0.09)。泪液tPA水平中值分别为0.46 (0.02)ng/ml和0.46 (0.12)ng/ml，差异无统计学意义。值得注意的是，在一半的DR患者(26例中的13例)中，泪液tPA水平无法检测到;然而，在没有DR的患者中，有8例(29例中)患者的泪液tPA水平未被检测到2）.

在DR患者中(n= 26)，轻度DR 14例，中重度DR 13例。轻度DR患者平均血清PAI-1水平为37.34 ng/mL，中重度DR患者平均血清PAI-1水平为28.95 ng/mL。轻度和中度至重度DR患者的眼泪PAI-1水平相似，均为0.21 ng/mL。轻、中、重度DR患者血清tPA水平分别为4.03 ng/ml和6.06 ng/ml。轻度DR患者泪液tPA水平为0.53 ng/mL，中度至重度DR患者为0.58 ng/mL。

我们进行了单变量分析，以确定两种蛋白质的血清和撕裂水平之间的关系。在DR患者中，血清PAI-1水平与泪液PAI-1水平无相关性，斯皮尔曼系数为0.028 (p= 0.928)。在该组中，血清和泪液tPA水平之间也没有相关性。在无DR患者中，血清与泪液PAI-1无显著相关性;血清tPA水平与泪液tPA水平呈中度正相关，p值不显著，p值为0.363。

我们还测量了两种蛋白质的血清和眼泪水平与其他变量的相关性。值得注意的是，PAI-1眼泪水平与BMI呈显著正相关(r = 0.555，p= 0.026)。在无DR组，血浆PAI-1水平与UACR呈显著正相关(r = 0.501，p= 0.013)。在有dr和没有dr的两组中，我们没有观察到血清和眼泪中PAI-1和tPA水平与任何其他变量之间的相关性3.而且4）.

所有的变量p单因素分析中< 0.25的进一步用多变量回归分析。在糖尿病持续时间、收缩压和舒张压等方面均无统计学意义。

本研究的目的是确定在DR患者和非DR患者中tPA和PAI-1的血清和泪液水平之间的关系，而不考虑DR的阶段。观察到，与无DR患者相比，DR患者的血清PAI-1水平明显更高，但DR患者和非DR患者的泪液PAI-1水平具有可同性。tPA水平没有得到类似的观察结果。我们没有观察到眼泪PAI-1和血清PAI-1水平之间的相关性。同样，我们也没有证明眼泪和血清tPA水平之间的相关性。

DR是糖尿病常见并发症之一，需要早期干预和治疗，以防止疾病进展和失明。在体液中容易检测到的生物标记物对有效的疾病管理可能非常重要。由于已知高PAI-1和低tPA水平与DR相关，目前的研究旨在确定这些蛋白质是否可以在眼泪中检测到，以及它们的眼泪水平是否与相应的血清水平和其他疾病相关参数相关。

T2DM是众所周知的动脉粥样硬化性冠状动脉疾病发展和心肌梗死沉淀的易感因素。因此，在过去的几十年里，人们对糖尿病对血液中纤溶系统的影响产生了极大的兴趣，其中包括纤溶酶原激活剂，特别是t-PA及其抑制剂PAI-1。t-PA是一种丝氨酸蛋白酶，它催化循环的纤溶酶原转化为纤溶酶。纤溶酶是一种相对非特异性的蛋白酶，它将纤维蛋白分解成其降解产物。由于纤溶酶原和t-PA都与凝块相关的纤维蛋白特异性结合，t-PA的作用在很大程度上是凝块特异性的，有助于溶栓[19］．另一方面，PAI-1抑制与凝块相关的t-PA;因此抑制其溶解新生血栓的能力。除了PAI-1水平升高与糖尿病患者冠状动脉疾病的相关性外，基线水平较高的PAI-1据报道是dr发病的独立危险因素。这项研究对858例患者进行了5年以上的随访[14］．在另一项研究中，血清PAI-1水平升高与终末期增殖性DR显著相关[20.］．由于许多研究人员已经报道了血清PAI-1水平升高与DR发展的关系，我们考虑估计DR患者眼泪中的PAI-1水平，并与无DR患者进行比较。根据先前的报道，我们观察到DR患者与无DR患者相比，血清PAI-1水平显著升高(p< 0.05)。而PAI-1的泪液水平在两组间无明显差异。有DR患者血清tPA水平虽较低，但与无DR患者差异不显著(p= 0.09)。此外，我们没有观察到两组患者的tPA撕裂水平有显著差异。值得注意的是，在一半的DR患者中，tPA的眼泪水平未被检测到，这表明tPA在眼泪中的表达非常低。然而，在没有dr的患者中，观察到血清和泪液tPA水平之间存在中度相关性。PAI-1水平没有得到类似的观察。可能是局部调节机制影响PAI-1的撕裂水平，因此缺乏相关性。但考虑到本研究纳入的患者数量较少，进一步的大队列研究可能有助于确认眼泪中这两种蛋白水平与血清中这两种蛋白水平的相关性。

在本研究中，我们还估计了血清和泪液中PAI-1和tPA水平与其他变量的相关性。值得注意的是，在dr患者中，眼泪PAI-1水平与BMI有显著的相关性。在之前的一项研究中，发现糖尿病患者中PAI-1活性的增加与腰围的增加有关[21］．其他研究也表明，血清PAI-1水平与肥胖和胰岛素抵抗呈正相关[22，23，24］．目前的研究首次观察到dr患者泪液PAI-1水平与BMI的显著相关性。尽管之前的研究报道了血清PAI-1与肥胖和胰岛素抵抗的相关性，但在目前的研究中，我们没有观察到这种相关性[25］．肥胖患者纤维蛋白溶解抑制与PAI-1升高之间有很强的联系。26]和病态肥胖患者BMI的降低被证明对纤溶系统产生了有利的影响，因为PAI-1水平的降低[27］．这种关联很可能在肥胖个体中显著存在，而在目前研究中BMI不等于肥胖的人群中不显著。

本研究还发现无DR患者血清PAI-1水平与UACR呈正相关。根据我们的观察，先前的一项研究表明，尿白蛋白排泄较高的糖尿病患者血清PAI-1水平明显升高[28］．在另一项研究中，抑制PAI-1可以防止糖尿病小鼠的肾损伤。因此，本研究观察了血清PAI-1与UACR水平的相关性。然而，同样的情况在DR患者中并不明显。尽管原因尚不清楚，但可能是性别差异(DR组的男:女为9:17，而非DR组为14:15)是促成因素。先前的一项研究表明，根据高血压和糖尿病等共病，与蛋白尿相关的因素在男性和女性中是不同的[29］．此外，其他可能有影响的因素包括DR和肾病的严重程度、持续的药物治疗以及血糖控制，尽管在目前的研究中，与HbA1c水平的正相关关系不明显。我们也没有观察到PAI-1和tPA水平与任何其他变量之间的相关性。

总之,当前研究发现PAI-1和tPA眼泪的糖尿病患者和无血清PAI-1博士水平明显更大的患者相比,那些没有博士博士正相关观察撕裂和病人血清tPA含量之间没有博士或许包含更大的患者群的潜在PAI-1和tPA作为潜在的生物标记物的管理博士进一步的研究涉及健康对照组could also provide a better comparative data, which was a limitation of the current study.

在当前研究中使用和分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

博士:

糖尿病性视网膜病变

2型糖尿病:

2型糖尿病

差:

四分位范围

UACR:

尿白蛋白与肌酐的比率

PAI-1:

纤溶酶原激活物抑制剂-1

tPA:

组织型纤溶酶原激活剂

体重指数:

身体质量指数

c反应蛋白:

c反应蛋白

糖化血红蛋白:

糖化血红蛋白

光纤光栅:

空腹血糖

我们要感谢所有参与者，医务人员和非医务人员，他们为完成这项研究做出了贡献。

不。

作者及隶属关系

1. 马拉理工大学(UiTM)，马来西亚雪兰莪州达鲁伊山，Sungai Buloh，内科系

   Nurbadriah binti Jasmiad和Rohana binti Abd Ghani

2. 马来西亚雪兰莪州达鲁伊山市双盖布洛市马拉理工大学病理、实验室和法医学研究所(I-PPerForM)

   Rohana binti Abd Ghani

3. 马来西亚吉隆坡国际医科大学医学院药理学与治疗学系

   雷努阿加瓦尔

4. 马拉科技大学医学院公共卫生医学系，马来西亚雪兰莪州达鲁伊山市双盖布洛

   Zaliha binti Ismail

5. 密歇根州立大学医疗中心，马来西亚雪兰莪州沙阿拉姆市波斯亚兰奥拉加

   Azlindarita Aisyah Mohd Abdullah

6. MSU卓越临床中心，管理和科学大学，沙阿拉姆，雪兰莪达鲁伊山，马来西亚

   Azlindarita Aisyah Mohd Abdullah

7. 马拉理工大学医学院医学分子生物技术研究所(IMMB)，马来西亚雪兰莪州达鲁伊山市双盖布洛

   Mohd Yusri Idorus

贡献

N.J.参与了概念化、方法学、数据收集、数据分析、统计分析、讨论、文献回顾和撰写手稿。R.A.G和R.A对重要知识内容的概念化、方法论、数据分析、批判性讨论、编辑和修订手稿做出了贡献。Z.I .负责统计分析和批判性讨论。点一个was involved in the data collection. M.Y.I contributed to the data analysis, technical aspect and laboratory equipment. All authors read and approved the final manuscript.

相应的作者

对应到Nurbadriah binti Jasmiad，Rohana binti Abd Ghani或雷努阿加瓦尔．

伦理批准并同意参与

这项研究是根据赫尔辛基宣言进行的，并获得了马拉理工大学研究伦理委员会的伦理批准(REF:600-IRMI(5/1/6))。所有受试者均获得书面知情同意书。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

开放获取本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，允许以任何媒介或格式使用、分享、改编、分发和复制，只要您对原作者和来源给予适当的署名，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否有更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可协议中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包含在文章的创作共用许可协议中，并且您的预期使用不被法定法规所允许或超出了允许的使用范围，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查看本牌照的副本，请浏览http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．创作共用公共领域奉献弃权书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本条所提供的资料，除非在资料的信用额度中另有说明。

转载及权限