糖对万寿菊次生开花调控机制的代谢分析木兰

背景

木兰是城市绿化中重要的传统观赏植物，因其花形优雅，花色艳丽，在中国已有2000多年的栽培历史。大多数种类的木兰每年春天开花一次，而其他一些，如木兰liliiflora白玉兰。“红元包”，也在夏季或初秋第二次开花。这种两次开花特性具有很高的观赏价值，但其潜在的机制尚不清楚。

方法

石蜡切片显示了开花时间和表型变化m . liliiflora2018年3月28日至8月25日两次花期的“红元宝”。采用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对‘红元宝’两次花芽分化过程中的化学代谢物进行了研究，并采用正交投影-隐结构判别分析(OPLS-DA)对代谢物进行了筛选和鉴定。利用京都基因与基因组百科全书途径富集分析(KEGG)揭示了糖代谢产物与两花期性状的关系。为了进一步研究蔗糖和海藻糖对‘红元宝’开花调控的潜在作用，从2019年4月22日起，在春花结束后定期喷洒浓度为30 mM、60 mM和90 mM的蔗糖和海藻糖溶液。采用定量反转录PCR (qRT-PCR)技术观察喷施植株花芽分化过程，研究蔗糖和海藻糖代谢途径相关基因的表达规律。

结果

结果表明，红元包在一年内可完成两次花芽分化，春夏两季均开花。花芽分化代谢产物在第一花芽和第二花芽之间存在显著差异。与第一次花芽分化过程相比，第二次花芽分化过程中蔗糖和海藻糖代谢途径中的代谢物显著上调。此外，一些海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)基因包括MlTPS1，MlTPS5，MlTPS6，MlTPS7和MlTPS9与第一次分化相比，在第二次分化过程中显著增加。外源处理表明，与对照植株(喷水、CK)相比，3种浓度海藻糖均能促进开花，其中60mm浓度的效果最为显著。对蔗糖叶面喷施，只有60mm浓度较对照加速开花。说明不同浓度的海藻糖和蔗糖可能有不同的效果。表达分析表明，蔗糖处理增加了MlTPS5和MlTPS6，而海藻糖处理则增加MlTPS1显示出不同MlTPS基因分别参与蔗糖和海藻糖的代谢途径。一些开花相关基因的表达水平，如MlFT, MlLFY,MlSPL对喷洒蔗糖和海藻糖的反应也有所增加。

结论

我们为蔗糖和海藻糖对开花过程的影响提供了新的见解木兰．在不同含糖量处理下，花芽分化时间木兰是先进的。叶片喷施蔗糖和海藻糖诱导和加速开花，加上海藻糖调控和响应基因的表达升高，表明次生花芽的形成是由内源蔗糖和海藻糖水平的改变促进的。这些结果使我们对蔗糖和海藻糖在双花中的作用有了新的认识木兰并为诱导和加速开花过程提供了初步的推测木兰。

开花是开花植物生殖过程的一个显著特征和重要组成部分，是植物界最大和最多样化的群体[1，2］．开花时间是植物生命周期中确保最大繁殖成功率的关键[3.，4，5］．在栽培育种过程中，观赏植物的花色丰富，花期多变，花期一般较长[2］．在开花植物中，大多数一年开花一次，这些植物被称为一次开花植物[6］．而有些植物可以在一年内再次开花，成为两次开花的植物，或在有利条件下继续开花，成为连续开花的植物[6］．

近年来，对植物开花的分子机制，特别是模式植物开花的分子机制进行了大量深入的研究拟南芥．研究发现，光周期、春化、热感觉、赤霉素、自主和衰老六大途径调控着花的发育过程[7，8］．已经发现许多基因可以整合通过这些途径接收到的信号，例如英国《金融时报》（花位t），AP1（APETALA1),LFY（多叶的) [9］．在答:芥，英国《金融时报》作为成花分子，将这个完整的开花信号传递给茎尖分生组织，从而触发开花[10］．AP1和LFY整合多种花诱导通路信号，激活花器官发育[11］．这些整合基因在植物中高度保守，包括苹果[12]，龙眼[13]和杨树[14］．

此外，已知糖和代谢途径会影响开花，并且与开花过程相关的代谢物也会发生变化[15，16］．糖被发现作为与开花控制途径相互作用的信号分子，如转录因子不定DOMAIN8（AtIDD8)，通过调节蔗糖的运输和代谢来控制开花答:芥［17］．此外，海藻糖还参与了开花植物许多重要的代谢和发育过程的调节[15，18，19，20.］．海藻糖-6-磷酸(T6P)是由udp -葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸通过T6P合成酶(TPS)，然后经T6P磷酸酶转化为海藻糖[21，22］．由于T6P在植物中以微量存在，因此它被认为是调节糖的信号分子[23］．在许多植物中，T6P的含量与内源蔗糖的含量密切相关[15］．这一显著相关性表明，T6P可能是蔗糖可利用性的信号，也是蔗糖积累的负反馈调节器[18］．在研究中答:芥结果表明，T6P通路可以在两个位点直接调控开花:TPS1的诱导需要活动英国《金融时报》,它通过整合来自六个主要途径的信号，在花期控制中起着核心作用[24];第二，T6P通路影响重要的开花相关基因的表达，如Squamosa启动子结合蛋白样（SPL)通过年龄途径[15］．综上所述，糖可能通过多种开花途径参与了开花的调节。据我们所知，糖在两次开花中的作用尚未被研究，这促使我们目前研究糖与植物两次开花之间的相互作用木兰．

木兰是城市绿化中重要的传统观赏植物，其花形优雅，花色艳丽，在中国已有2000多年的栽培历史[25，26］．大多数种类的木兰每年春天开花一次，而少数可以在夏季或初秋再次开花[27］．两次开花的特点木兰极大地提高了其观赏价值和研究价值，对了解植物次生开花的分子调控机制具有重要意义木兰．木兰liliiflora“红元包”是两次开花的一种木兰春天和夏天都开花的品种[28］．为探讨影响红元宝花蕾次生开花的因素，对红元宝花蕾分化过程中的生化代谢进行了研究，鉴定出多种可能影响花蕾发育的代谢化合物。此外，研究了两花代谢途径相关基因的表达水平，为了解两花代谢调控及其分子机制提供了重要线索。

‘红元宝’百合花芽分化的两个不同时期的鉴定

目的:揭示植物的开花时间和表型变化m . liliiflora用石蜡切片定期观察‘红元宝’花芽分化的全过程。许多木兰在前一年完成花芽分化过程后，在春季或夏季开花一次。相反，我们发现‘红元宝’每年完成两次分化过程，并且在春季和夏季都开花(图2)。1A)根据“红元宝”花芽分化的形态特征，我们将其分为以下六个阶段(同样用不同的颜色表示)(图2)。1B):未分化、早期花芽分化、萼片原基分化、花瓣原基分化、雄蕊原基分化、雌蕊原基分化。植株表型观察表明，去年完成花芽分化的春花主要产在去年枝条的顶端。4月22日至5月30日，随着春花的落花，新枝生长，枝条顶部出现第一次芽分化。第一次花蕾在6月(夏花)开始变大开花，第二次花蕾分化在8月底开始并结束。第二次的花蕾将在第二年春天开花。(无花果。1)。这一现象表明春夏花蕾的发育和开放过程存在差异，可能与植物营养状况和环境条件的变化有关[9，29］．

第一和第二花芽分化中初级代谢物的非靶向代谢组学比较

为了探索二次开花特性的机制，我们在4月和6月收获了早期(未分化，S1和S4)、中期(萼片原基和花瓣原基分化，S2和S5)和后期(雄蕊原基和雌蕊原基分化，S3和S6)的芽(图6)。1)。采用气相色谱-质谱(GC-MS)分析了两个芽分化期的主要代谢物。在大多数代谢组学数据分析中，与感兴趣的变量正交的混杂因素可能会模糊预期的类别分离。为了分析这些数据，我们比较了两种不同的分析方法:主成分分析(PCA)和正交投影到潜在结构判别分析(OPLS-DA)。对于PCA，我们的分类变量是模糊的，并且变量分散在几个主成分上。因此，无法进行更好的可视化和后续分析(附加文件)1)。因此，我们测试了OPLS-DA作为一种替代方法，可以过滤掉分类变量中不相关的正交变量。然后，我们能够分析非正交和正交变量(图2)。2)。Q2值代表OPLS-DA模型的预测能力，对于生物样品，Q2≥0.4为理想[30.］．结果表明，初生和次生花蕾各比较的OPLS-DA评分图具有总体交叉验证系数，Q2(y)分别为58、78和77%。结果表明，OPLS-DA模型比PCA更适合于“红元包”的样本类别预测。to1和t1的坐标值显示了两组之间第一个预测分量的明显分离(图2)。2A-C)，显示组间和组内差异。

为了研究代谢物与二次开花表型之间的关系，我们利用初生花蕾和次生花蕾的代谢谱进行了分层聚类分析(图2)。2)。共鉴定出41种差异代谢物(附加文件)2)。基于Mass Bank和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)和LECO-Fiehn Rtx5数据库的分析[31，32]，将41种代谢物分为6组:羧酸及其衍生物(包括12种化合物)、有机氧化合物(13种)、脂肪酰基(5种)、丙烯醇脂类(3种)、吲哚及其衍生物(2种)和其他化合物(6种)。与第一次花芽分化相比，第二次花芽中大多数糖和有机酸含量较高，谷氨酸、热谷氨酸、苹果酸、柠檬酸和2-氧戊二酸含量降低。结果表明，在第二花蕾中，d -塔卢糖1和6-脱氧-d -葡萄糖1的糖含量在早期增加，蔗糖、海藻糖、半乳糖2、木糖1和其他一些糖的含量在中期增加。第二个花蕾在后期具有比第一个花蕾更高的糖含量，包括海藻糖、红酶2和d-葡萄糖庚糖1。这些数据表明，许多代谢物，特别是糖，是第二花芽分化所必需的。

百合‘红元宝’代谢物的相关性研究

目的:研究牡丹不同花芽分化阶段代谢物的相关性m . liliiflora“红元宝”，Pearson相关性用于计算三个不同发育阶段代谢物谱的相似程度。MetaboAnalyst 4.0 (http://www.metaboanalyst.ca) [33]用于绘制代谢物之间的相关网络。S1、S2、S3和S4、S5、S6分别代表一芽分化的早期(未分化)、中期(萼片分化和花瓣分化)和后期(雄蕊分化和雌蕊分化)阶段。结果显示，在第一花蕾和第二花蕾之间，22、41和25种代谢物在早期、中期和后期存在差异(图2)。3.a - c)。通过分析花芽分化各阶段差异代谢物的相互作用，筛选关键差异代谢物和代谢途径，构建相关网络。这些网络表明，在早期的差异代谢物中，甲基丙二酸、4-羟基肉桂酸、4-羟基苯甲酸和羟基乙酸与其他差异代谢物的相互作用最为密切。蔗糖、草酸和谷氨酸与其他差异代谢物的相互作用在中期最为密切。戊二酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、海藻糖和亚麻酸在后期与其他差异代谢物的相互作用最为密切(图2)。3.)。此外，我们还发现在S2和S5的比较中，代谢物的活性和关联比S1和S4、S3和S6的比较更为突出(图2)。3.)。结果表明，在这些差异代谢物中，糖代谢物与其他代谢物密切相关，糖代谢途径可能在第一和第二花芽分化过程中发挥重要作用。

糖代谢产物的KEGG富集分析及MlTPS基因的表达

KEGG富集分析结果表明，蔗糖和淀粉代谢途径中的蔗糖和海藻糖在第二个花蕾中比在第一个花蕾中显著上调(附加文件)3.,无花果。4A). T6P是蔗糖可用性的信号，由udp -葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸合成TPS基因(18，21］．但只有五个TPS在两次开花过程的芽混合物转录组中发现了基因，命名为MlTPS1，MlTPS5，MlTPS6，MlTPS7和MlTPS9分别。的表达水平MlTPS然后用qRT-PCR分析两次开花过程中的基因。结果表明MlTPS基因在二次分化过程中存在显著差异。与第一次花芽分化相比，MlTPS1，MlTPS7和MlTPS9在表达上是最突出的，和MlTPS5在第二花芽分化过程中几乎看不出来(图2)。4B).总体趋势表明MlTPS基因在第二花芽分化中期显著增加(图2)。4)，暗示潜在的功能作用MlTPS二花芽分化的基因。

海藻糖促进提早开花

为了证实蔗糖和海藻糖对二重花性状的影响m . liliiflora2019年4月22日，浙江农林大学苗圃里种植的“红元宝”植株在春花结束后被喷洒了蔗糖和海藻糖溶液。开始叶片喷洒三种浓度(30mm、60mm、90mm)的蔗糖和海藻糖(图2)。5A).以喷施去离子水的植株为对照(CK)。每5 d对所有植株的叶片进行喷施，并于第一次喷施后的第20天和第35天采集样品进行显微镜观察。

石蜡切片结果显示，在第20天，海藻糖处理植株的发育速度明显快于对照和蔗糖处理植株。海藻糖处理下，芽已进入成花过渡阶段，而蔗糖处理和对照的芽仍未分化(图2)。5B).然而，发育速度与海藻糖浓度没有直接相关。海藻糖浓度为90 mmol/L的植株仅实现了早期花芽分化，而浓度为30和60 mmol/L的植株分别实现了萼片和花瓣原基分化。在第35天，海藻糖和蔗糖处理均能促进花的发育过程。海藻糖处理植株，60和90 mM处理已完成花芽分化，30 mM处理已进入雌蕊分化阶段。喷施60mm蔗糖的植株处于雌蕊发育阶段，喷施30mm和90mm蔗糖的植株处于雄蕊发育阶段，与对照相同。综上所述，这些结果表明，喷洒不同浓度蔗糖和海藻糖对‘红元宝’叶片花芽分化的影响是不同的，海藻糖对花芽分化过程的促进作用是显著的(图2)。5B)。

蔗糖处理下TPS基因及开花相关基因的表达

为了更清楚地了解海藻糖和蔗糖是否影响两次开花表型，我们探索了糖应答基因和开花调控基因的表达。具体来说，我们关注的是TPS家族MlTPS1，MlTPS5，MlTPS6，MlTPS7和MlTPS9，以及关键的花整合基因MlFT，MlLFY，MlCO,MlAP1．前人研究表明，相对于对照和其他处理植株，分别喷洒60 mM海藻糖和蔗糖能明显促进花芽分化过程(图2)。5B)MlTPS对60 mM海藻糖和蔗糖处理和CK条件下‘红元宝’叶片的花整合子基因和花整合子基因进行了检测(图2)。6)。

很明显，MlTPS基因在花芽分化期广泛表达。用60mm海藻糖溶液处理，相对于对照，MlTPS1和MlTPS5在中期(25d)和后期(40d)，MlTPS6在最初增加后下降。的表达式MlTPS7和MlTPS9保持不变。结果表明:MlTPS1和MlTPS5可能是对海藻糖处理的反应，以调节开花。在60 mM蔗糖处理下，MlTPS1几乎检测不到，而MlTPS5初始增加后减少。的表达式MlTPS6和MlTPS7均高于对照，且MlTPS9表达式保持不变，说明MlTPS6和MlTPS7可能对蔗糖处理加速开花有重要作用。此外，开花整合子也对糖处理有反应(图2)。6)。的表达式MlFT，与分化时间相关，海藻糖和蔗糖处理均高于对照处理MlFT可能对开花起着至关重要的作用。的表达水平MlLFY在花分化初期比分化后期含量高，提示其在花分生组织发育中的功能作用。的表达式MlCO在糖的作用下有适度的提高，而MlAP1没有反应。这些结果表明MlTPS基因可能响应糖信号调控花的分化，加速开花可能依赖于基因表达的增强MlFT和MlLFY．

糖处理后转录因子SPL的表达分析

SPL基因受多种开花信号调控，参与年龄通路调控开花[34］．在其他物种中，SPL3被认为是T6P通路的参与者，并影响开花过程[15］．因此，我们想知道是否SPL3‘红元宝’同源基因对海藻糖和蔗糖处理均有响应。我们确定了两个MlSPL3基因(MlSPL3-1和MlSPL3-2)，并在第20天测定它们是否对海藻糖和蔗糖处理有反应。MlSPL3-1两种糖处理下的表达量均显著高于对照，海藻糖处理的表达量相对高于蔗糖处理(图2)。7时)。MlSPL3-2海藻糖处理下有显著表达，总表达量为MlSPL3-2喷施海藻糖后比喷施蔗糖后高(图2)。7 b)。这些结果表明，T6P通路可以影响花形基因的表达MlSPL3通过年龄途径促进花的分化过程。

百合‘红元宝’开花的多种机制

由于开花时间对有性繁殖的成功与否至关重要，因此作物的生产力和产量[34]，已经建立了许多模型答:芥还有一些农作物。这些模型也被用于研究观赏植物花芽分化控制的分子机制。然而，观赏植物对多次开花的具体要求直到最近才成为一个热门的研究课题，原因是商业兴趣日益浓厚[35，36］．花芽分化是植物由营养生长向生殖生长转变的生理形态标志[36］．整个过程包括花芽分化前的诱导阶段和花分化的具体过程[37］．“Hongyuanbao”,m . liliiflora品种，2001年引进中国[5］．其观赏特征多年来较为稳定，尤其是两次开花表型。在之前的一项研究中发现了“红元包”的两次开花现象[5]，但对其开花机制仍缺乏深入的认识。本研究通过对整个花期开花时间和花芽分化的观察，发现‘红元宝’花芽分化明显，分别在春季和夏季出现第一次和第二次分化。

近年来，植物代谢组学受到越来越多的关注，糖被认为是调控植物发育过程中多种基因的信号分子。为了进一步揭示‘红元宝’花芽两次分化的潜在机制，我们将整个花芽分化过程划分为6个阶段。对两个不同花蕾在这6个阶段的代谢组学分析表明，糖含量在二花蕾分化的整个过程中显著增加。蔗糖和海藻糖主要发生在中期(萼片分化和花瓣分化)，海藻糖也在后期(雄蕊分化和雌蕊分化)积累。这表明蔗糖和海藻糖可能在花芽分化过程中起重要作用，尤其是在次生花芽分化过程中。

蔗糖和海藻糖在两次花芽分化和开花过程中起着重要作用

糖作为碳代谢的基本分子，在植物的整个生命周期中都可以作为能量物质或信号分子。许多植物系统，如菊花[38]，答:芥［15，39]和苹果[40，41已被广泛用于研究糖代谢。最近的研究发现，糖可以作为一种信号分子，与其他无机调节网络相互作用，从而影响植物从营养生长到生殖生长的转变[42，43］．与之前的研究一致，对‘红元宝’花蕾的代谢组学分析证实了糖在花蕾分化过程中的重要性。为探讨糖在双花芽分化过程中的功能作用m . liliiflora将蔗糖或海藻糖溶液喷洒在植物叶片上，称为“红元宝”。结果表明，蔗糖和海藻糖处理均能促进花的形成，海藻糖的作用比蔗糖更为显著(图2)。5)。

如图3所示。8， T6P作为一种信号分子，将碳水化合物可利用性信息传递给其他信号通路，在糖代谢途径中发挥重要作用[15］．T6P通路响应糖信号并基于两个不同的方面调控开花。在植物的叶子里，TPS1在春季白昼长度增加的情况下，T6P被激活，从而产生T6P，诱导花原的表达英国《金融时报》调节花期[15，42］．此外，T6P通路影响SPL3直接通过SAM的年龄路径，与日长无关(图2)。8)。

因此，我们筛选并鉴定了5种MlTPS和两个MlSPL3基因m . liliiflora“Hongyuanbao”。的表达式MlTPS采用qRT-PCR技术对不同阶段的基因进行验证。它表明MlTPS1, MlTPS6, MlTPS7均在糖处理下显著增加，提示MlTPS开花调控过程中的基因。以前的研究答:芥我也发现AtTPS1能促进开花，同时敲出吗AtTPS1基因会导致开花延迟[44］．然而，的作用AtTPS6和AtTPS7在开花调控方面还没有进一步的研究AtTPS9与抗逆性有关[45］．光周期是每天反复出现的光照和黑暗周期，可以调节糖的积累[46］．我们试图假设，在第二花芽分化的时间框架内较长的光周期导致多糖的积累，从而促进多糖的表达MlTPS1和次生开花(图2)。8)。T6P通路也可能通过衰老途径，通过表达SPL3［15］．在这项研究中，我们发现MlSPL3糖处理下的表达可能受到外源糖处理的诱导。

总之，我们的研究表明m . liliiflora与玫瑰和草莓的连续开花不同，“红元宝”在春季和夏季可以经历两个花芽分化周期。蔗糖和海藻糖在次生花芽分化和开花过程中起着重要作用，可能是通过激活TPS和SPL基因。

植物材料和生长条件

实验是用3个10岁的花蕾进行的m . liliiflora“红元包”，种植于中国浙江农林大学。所有成熟的树木都按照普通的栽培方法进行管理。在整个花芽分化过程中，于2018年4月22日至8月21日每隔5天下午2点左右从树冠中上部采集花芽，进行后续观察分析。待分析的芽保存在- 80°C，直到提取。

形态学观察

为了了解‘红元宝’的开花时间和表型变化，我们每隔5天采集3种植物的10个花蕾，保存在FAA固定液(50%乙醇:甲醛:冰醋酸比例为8:1:1)中进行石蜡切片观察。将样品切片至10 μm厚度，进行红花素快绿染色30 s。样品用中性橡胶密封，然后使用Axio Imager A2阳性荧光显微镜(Carl Zeiss, Oberkochen，德国)观察和拍照。同时用解剖显微镜观察芽的发育过程[47］．

气相色谱-质谱分析

每种样品各取50 mg置于2 mL聚乙烯管中，加入400 μL冷萃取液(VMethanol: VH2O = 3:1)， 20 μL甘露醇为内标。在管中加入一个钢球以辅助40 Hz磨床(JXFSTPRP-24, Shanghai Jingxin Experimental Technology, Shanghai, China)的磨削。研磨4分钟后，样品在冰浴中超声处理5分钟。将样品与200 μL氯仿和400 μL水混合，在4℃下13500 × g离心15 min。最后收集上清液200 μL，真空干燥蒸发于玻璃取样瓶中。样品采用气相色谱-质谱联用(GC-MS) Agilent 7890 GC-TOFMS，配备Agilent db - 5ms毛细管柱(30 M × 250 μm × 0.25 μm, J & W Scientific, Folsom, CA, USA)。

数据处理与分析

采用LECO公司Chroma TOF 4.3X软件和LECO- fiehn Rtx5数据库进行原峰提取、数据基线滤波和基线校准、峰对中、反卷积分析、峰识别和峰面积整合。在代谢物鉴定中同时考虑了质谱匹配和保留指数匹配。去除在< 50%的QC样品或RSD>30%的QC样品中检测到的峰。使用SIMCA软件(v.14)进行多变量模式识别和数据归一化。采用主成分分析和OPLS-DA法鉴别实验组的代谢变化。在KEGG数据库中绘制了相应的代谢途径P值采用Student’s T检验计算，显著性水平设为p< 0.05。为了缩小任何可能的方差并提高下游统计分析的性能，对代谢物数据进行数据完整性检查，并使用MetaboAnalyst4.0的规范化协议(选择通过求和、对数变换和自动缩放进行规范化)进行统计分析。热图由OriginPro2015 (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA)生成。

代谢差异的筛选和鉴定

根据离子峰匹配的命名条件，共获得569个非靶向代谢物。采用多元统计方法将治疗组与对照组进行比较，筛选出治疗组中所有差异表达的化合物。对于生物复制代谢物，结合P-value和OPLS-DA (29 thsamvenot E A, 2015)模型中具有可变重要性的投影(VIP)值的变量用于筛选差异代谢物。筛选标准为P< 0.05。VIP > 1.0被认为与群体歧视有关。

RNA提取，Illumina测序，组装和注释

利用NEBNext poly(A) mRNA磁分离模块提取总RNA并富集poly(A) mRNA。测序cDNA的合成遵循牛津纳米孔技术的链开关协议。cDNA文库由biomker TECHNOLOGIES(北京，中国)在Illumina HiSeq 4000测序平台(Illumina, San Diego, CA, USA)上测序，得到2 × 150 bp的对端原始reads。测序后的原始读数使用FastQC进行质量检查[48］．适配器序列从原始读取中删除。歧义N核苷酸比例大于5%的Reads和低质量序列(质量评分小于20)的Reads被删除。测序reads使用Trinity软件在默认参数下重新组装，k-mer大小为25 [49］．使用来自所有复制和阶段的汇总读数组装转录组。在后续分析之前，生物标志物技术公司对装配质量进行了严格评估。组装的转录组序列被命名为“unigenes”。使用BLASTx在6个常用数据库中查询所有的同源物(e值< 10)⁻¹⁰)。使用的数据库为Swiss-prot [50]， n [4]，酒桶[31]， kog [51]， Pfam [52]和GO [53］．

蔗糖和海藻糖处理诱导开花

选择21株大小和生长相近的植物在坪山基地试验站种植。2019年4月22日，植株春花结束后，从上到下喷洒浓度为30 mM、60 mM和90 mM的不同蔗糖或海藻糖溶液。以喷过水的植株为对照(CK)。包括CK在内的每个处理都有三株植株。所有植株叶片每5 d喷施1次，第一次喷施后第20天和第35天取样品进行显微镜观察和基因表达分析。茎尖分生组织开始扩张时采集茎尖进行细胞学观察，作为花芽形成的标志。

蔗糖处理下MlTPS基因的RNA提取及qRT-PCR分析

用RNAprep Pure Plant Kit (TianGen, Beijing, China)从‘红元宝’芽中提取总RNA，用核酸分析仪(Implen Company in Germany)检测质量。第一链cDNA由HiScript®III逆转录酶(Vazyme，南京，中国)合成。基因的表达包括MlTPS1，MlTPS5，MlTPS6，MlTPS7和MlTPS9，以及关键的花整合基因MlFT，MlLFY，MlCO，MlAP1，MlSPL3-1和MlSPL3-2具有序列相似性拟南芥从转录组学数据中鉴定出基因m . liliiflora通过BlastX标注，在Light Cycller 480II Real Time PCR系统(Roche, Basel, Switzerland)上进行定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)检测。MlACTIN（MlACT)作为内参基因，并在附加文件中分析其稳定性4［27］．反应体系为:SYBR Premix ExTaq 10 μL, cDNA 2 μL，上下游引物各10 μmol/L, ddH 8 μL₂O添加至20 μL。反应程序为95℃30 s, 95℃5 s, 60℃30 s，共40个循环:95℃5 s, 60℃1 min, 95℃15 s。所有qRT-PCR实验均进行3个生物重复。比较对照组和治疗组基因表达水平。采用方差分析(Anova)计算差异有统计学意义，然后进行TukeyHSD分析。使用SigmaPlot 10.0 (Systat Software Inc.， San Jose, CA, USA)进行基因表达模式分析，并使用2^−∆∆Ct方法(22］．

本研究过程中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章和附加文件中。本研究过程中产生的任何其他数据，如有合理要求，可向通讯作者索取。

KEGG:

京都基因与基因组百科全书

TPS:

Trehalose-6-phosphate合酶

T6P:

Trehalose-6-phosphate

OPLS-DA:

正交投影对潜在结构的判别分析

CK:

未经任何处理的植物

英国《金融时报》:

开花地点

LFY:

多叶的

AP1:

APETALA1

我们感谢编辑和两位匿名审稿人对本文的评论。我们感谢Dong Meng(北京林业大学)为本文提供的建议，Chao Zhang博士分享的实验知识，以及Rohul Amin(北京林业大学)编辑的语言。

植物材料说明

本文中对植物(无论是栽培的还是野生的)的所有实验研究和实地研究，包括植物材料的收集，都符合相关的机构、国家和国际准则和立法。

项目资助:浙江省农业新品种选育重点科技资助项目(2021C02071-3);《浙江省农村生态景观建设技术研发重点项目-浙江省农村生态景观建设技术研发与推广示范(2019C02023)》和《浙江省农村生态景观建设技术研发与推广示范应用》木兰玉兰，中国上海(20dz1203700);

作者指出

1. 宣玲娟、王倩倩、刘志高、徐斌对这项工作也有同样的贡献。

作者及单位

1. 浙江农林大学园林学院，浙江杭州311300

   宣玲娟，王倩倩，刘志高，徐斌，程少玉，张英佳，卢丹英，董斌，马晶晶，沈亚梅

2. 上海市园林科学与规划研究院，上海200232

   张冬梅，张朗

贡献

概念化，y.s.， J.M.和B.D.;方法论，Y.S.和L.X.;软件,L.X.;验证，Y.S.和b.d.;形式分析，李立新，祁伟文，张志林，B.X.;调查，s.c.， Y.Z.和D.L.;资源、D.Z.和L.Z.;数据管理，Y.S.和L.X.;写作-原稿准备，L.X.和q.w;文评与编辑，李立新、祁伟、张志林; visualization, L.X., Q.W. and Z.L.; supervision, Y.S., B.D. and J.M.; project administration, Y.S.; funding acquisition, Y.S. All authors have read, reviewed, and agreed to the published version of the manuscript.

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对应到本董，晶晶马或亚美沈．

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不适用。

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不适用。

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作者声明没有竞争利益。

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