通过氟他胺和无雄激素环境促进Lncap-AI前列腺癌细胞系的建立

背景

从Lncap雄激素依赖(AD)细胞系中建立去势抵抗性前列腺癌(CRPC) - Lncap雄激素独立(AI)细胞系，并探讨这两种细胞系的分子生物学差异。

方法

培养Lncap-AD细胞系，16个月传代60次。观察Lncap-AI细胞系的形态变化。采用qRT-PCR和Western Blot检测AR水平。采用CCK-8法、EdU法、创面愈合法和细胞粘附法观察细胞增殖、迁移和粘附能力。利用扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)观察微培养结构。最后，采用Elisa法检测小鼠PSA的分泌能力。

结果

培养Lncap-AD细胞系，16个月传代60次。与Lncap-AD细胞株相比，Lncap-AI细胞株在培养末期出现了形态变化，细胞变细，细胞间隙分离。与Lncap-AD细胞系相比，Lncap-AI细胞系中ar相关基因的相对mRNA和蛋白水平均上调。恩杂鲁胺能影响和下调Lncap-AD细胞株中AR和HK2蛋白的表达，而在Lncap-AI细胞株中差异不明显。CCK-8、EdU、创面愈合和粘附实验均显示Lncap-AI细胞株具有较强的增殖、迁移和粘附能力。扫描电镜观察发现，Lncap-AI细胞系和PC3细胞系中突触数量较多，而Lncap-AD细胞系中突触数量较少。最后，采用Elisa法对不同PCa细胞系的PSA分泌能力进行评价，结果显示各组间差异无统计学意义。

结论

模拟CRPC的进展，通过雄激素剥夺治疗，Lncap-AD细胞株向Lncap-AI细胞株转变。

前列腺癌(PCa)是世界十大男性恶性疾病，在大多数国家导致男性相关癌症死亡[1]。早期前列腺癌可以通过磁共振成像技术和早期前列腺特异性抗原(PSA)筛查的普及进行诊断[2]。此时，肿瘤也局限于前列腺组织，采用手术和放疗可取得良好效果[3.]。雄激素剥夺疗法(ADT)早期治疗效果良好。然而，在ADT阶段，前列腺癌会从雄激素依赖型向雄激素非依赖型发展，称为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。然而，去势抵抗性前列腺癌(CRPC)患者预后较差，因为激素剥夺治疗的疗效只是暂时的，大多数患者在接受雄激素剥夺治疗(ADT) 6-18个月后出现激素不依赖[4]。一旦PCa进入非激素依赖状态，癌细胞就可以抵抗ADT引起的肿瘤抑制。目前尚无有效的治疗方法来延长这些患者的生存时间。5]。

前列腺癌细胞模型分为雄激素依赖型和非雄激素依赖型。PCa细胞，如PC3和DU145，不表达雄激素，这些细胞系可以在缺乏激素的气候下生长。目前，只有Lncap细胞系在人类中保留PCa雄激素依赖特征，分泌PSA、PsMA和雄激素，并通过维持类固醇激素而增加。因此，Lncap是最常用的前列腺癌细胞系。然而，很难探索前列腺癌在雄激素依赖状态下与非依赖进展状态下的机制细节。尽管一些研究提供了关于雄激素在许多方面不依赖于PCa的机制的有价值的信息[6，7，8]。但是PCa从雄激素依赖性到雄激素非依赖性转变的分子生物学尚未得到很好的理解。一个主要的研究障碍是缺乏理想的细胞模型。一个完美的PCa细胞模型应该显示雄激素依赖特性，表达雄激素受体在雄激素缺乏的环境中转化为雄激素独立。

细胞粘附是细胞与分子之间相互联系的细胞外机制。细胞粘附功能可参与多种生理病理过程，如胚胎发育和分化、正常组织结构的维持、炎症反应、免疫反应、凝血和血栓形成、创伤修复、肿瘤浸润和转移、胚胎发生等。细胞粘附也是肿瘤标志的一个重要特征，它与转移有密切的关系[9，10，11]。目前，细胞粘附机制已成为肿瘤细胞侵袭转移研究的热点之一。在一些前列腺癌研究中，细胞粘附可通过调节E-Cadherin影响转移[9]， GRP78, amydalin等，本研究旨在从雄激素依赖型Lncap (LncapAD)细胞系出发，在去势雄激素环境下建立雄激素非依赖型Lncap (LncapAI)细胞子系统，并探索更合适的方法来完善培养方案，提高Lncap- ai细胞系的建立效率。

细胞培养

Lncap细胞系(5代)，由富恒有限公司提供。，Shanghai, China) was digested with 1 mL 0.25% Trypsin Digestion solutions with EDTA (Solarbio, catalog number: T1350) at 37 °C for 50 s. The cells were cultured with androgen deprivation condition in culture medium RPMI Medium 1640(gibco, catalog number: 11835-030) with 10% Certified Foetal Bovine Serum (FBS) Charcoal Stripped (Biological Industries Pricelist, catalog number: 04-201-1 A), 1% GlutaMAX-I (gibco, catalog number: 35050-061) and 1% Sodium Pyruvate (gibco, catalog number: 11360-070). The culture medium was replaced every five days. Incubator until the cells get reach ~ 80% confluence to cell freezing or cell passage.

细胞处理和细胞形态

将细胞置于10 cm培养皿中，与氟他胺(Yuanye, shanghaiyuananye Bio-Technology™，目录号:H20A9Z68074)共培养，37℃持续培养60-80代。氟他胺的浓缩量为:0 ~ 20代0.1µM, 21 ~ 40代0.5µM, 41 ~ 60代2.5µM。用光学显微镜(Mshot, Guangzhou, China)对细胞进行观察和拍照。

血红素-伊红(HE)染色

多聚甲醛预固定comasmase后，细胞经苏木精染色15 min, 1%盐酸酒精分化10 s。接下来，将样品置于自来水流下15分钟，并用伊红染色60秒，直到适当的染色颜色和中性树脂切片。用光学显微镜(EVOS FL Auto, life technologies, Japan)观察细胞。

定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)

用美国Invitrogen/Life Technologies公司(Carlsbad, CA, USA)的TRIzol试剂从PCa细胞系中提取总RNA，用PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa, Dalian, China)反转录为互补DNA (cDNA)。引物由PrimerBank (https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)，由GenSys (GenSys，广西，中国)合成。AR1，正向，5 ' - CCAGGGACCATGTTTTGCC−3 '，反向，5 ' - CGAAGACGACAAGATGGACAA−3 ';AR2，正向，5 ' - gacgaccagatggctgtcct -3 '，反向，5 ' - GGGCGAAGTAGAGCATCCT-3 ';FKBP5，正向，5 ' - CTACACCTGCTGAAGGGACG−3 '，反向，5 ' - CTCCAGCAAACCCTGGTACA−3 ';step 1，正向，5 ' - actgggcacaatacacgcat−3 '，反向，5 ' - GGTGACGTCTTCCCAACCAT-3 ';ALCAM，正向，5 ' - tcctgccgtctgctcttct -3 '，反向，5 ' - TTCTGAGGTACGTCAAGTCGG -3 ';ESAM，正向，5 ' - ggggtcacaacaagcaaacc -3 '，反向，5 ' - TTGTCTTGCACATTCACGGAG-3 ';ICAM1，正向，5 ' - ATGCCCAGACATCTGTGTCC−3 '，反向，5 ' - GGGGTCTCTATGCCCAACAA−3 ';ICAM2，正向，5 ' - CGGATGAGAAGGTATTCGAGGT−3 '，反向，5 ' - CACCCACTTCAGGCTGGTTAC−3 ';L1CAM，正向，5 ' - TGTCATCACGGAACAGTCTCC−3 '，反向，5 ' - CTGGCAAAGCAGCGGTAGAT−3 '; MCAM, forward, 5’- AGCTCCGCGTCTACAAAGC − 3’, reverse, 5’- CTACACAGGTAGCGACCTCC − 3’; GAPDH, forward, 5’- GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT − 3’, reverse, 5’- GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG − 3’. qRT-PCR was performed at 95ºC for 600 s, followed by 35 cycles of 95 °C for 15 s, 61 °C for 60 s, and 72 °C for 10 s, melting of 95 °C for 10 s, 65 °C for 60 s, and 97 °C for 1 s, then cooling of 37 °C for 30 s used a LightCvcler 96. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was selected as the internal reference. The relative expression of mRNA was calculated by the 2-∆∆Ct method.

免疫印迹

用细胞裂解缓冲液(Beyotime，目录号:P00138)提取总蛋白。在10% SDS - PAGE凝胶试剂盒(PG112, Epizyme，上海，中国)上分离蛋白质，并转移到PVDF膜(Millipore, Billerica, MA, USA)上。用NcmBlot阻断缓冲液(Cat#P30500, NCM Biotech，苏州，中国)阻断后，用一抗在4℃孵育过夜，然后用二抗(Goat Anti-Rabbit IgG-HRP, Abmart, Shanghai, China)孵育。蛋白质条带是用BeyoECL Plus (Beyotime)在Image Quant LAS500 (GE Healthcare, JAPAN)上开发的。抗兔多克隆PSA (1:1 000, Abcam ab53774, Cambridge, MA, USA)、兔单克隆AR(1:3 000)、兔单克隆HK2(1:3 000)、兔多克隆Βaction(1:2 000)的一抗(均来自Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)。以β-肌动蛋白为加载对照。以Enzalutamide (1 μm/ ml, A3003, APExBIO, Houston, USA)作为AR抑制剂。采用图像检测软件image J (Version 1.53 h)对各波段的相对密度进行量化。

5-乙基-2 ' -脱氧尿苷(EdU)测定

100t assay Cell-Light Apollo 567染色试剂盒(Cat#C10371-1, RIBBIO，广州，中国)含有EdU, Apollo成分试剂。在RPMI培养基1640中稀释EdU(1:1000) 100µl;gibco)应用于每一个96孔板和孵化后在黑暗中4 h。100µl的磷酸盐为5分钟(PBS)洗涤3次,多聚甲醛固定30分钟,100µl的甘氨酸和100µl Triton x - 100分离10分钟最后,200µl赫斯特的应用和在黑暗中培养了20分钟。最终,EdU-labeled Hoechst-stained细胞被抓获。

伤口愈合试验

将PCa细胞接种于6孔板中。允许细胞继续生长，直到达到汇合。然后用100 ul的微移管尖划伤细胞单层，用PBS冲洗漂浮的细胞。在不含FBS的灌注培养基中继续培养细胞，以排除增殖影响。并在48 h内捕获PCa细胞的迁移，在Image J软件(Version 1.53 h)中测量迁移距离和迁移面积。

细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)测定

在指定时间，用CCK8试剂盒(10µl/孔，NCM，目录号:C6005)处理PC3细胞1小时。使用微孔板吸光度仪EPOCH2 (BIO-TEK，美国)在450 nm处记录吸光度。

细胞粘附试验

将纤维连接蛋白(100µl/孔，Solarbio)或I型胶原蛋白(10µl/孔，Solarbio)置于96孔微孔板上，37˚C孵育8小时，然后将灭活胎牛血清(FBS, 200µl/孔，Solarbio)在37˚C孵育1小时。用PBS缓冲液冲洗孔三次，然后加入培养基再次冲洗。将制备的细胞悬浮液等分(1 × 10E4个细胞)加入孔中，在37℃的细胞培养箱中培养48 h。无贴壁细胞洗涤后，用CCK8试剂盒(10µl/孔)孵育4小时，在OD450下定量。

细胞粘附信号

酒桶(https://www.genome.jp/kegg/)数据库，得到细胞粘附信号通路，包括26个基因:https://portals.broadinstitute.org/ccle/)数据库查找细胞黏附表达在前列腺癌和前列腺组织细胞系中。

扫描电子显微镜(SEM)

采用扫描电镜(SEM)对CRPC膜进行观察。以PC3密度接种细胞，将Lncap-AD细胞系作为阳性对照和阴性对照。从孔中提取CRPC细胞株，去除培养基，在3%戊二醛中4℃固定标本。在一系列分级乙醇中脱水(50,70,80,90和100%)[12]。使用日立HCP-2临界点干燥机(日本)风干标本，并使用Eiko IB5离子镀膜机(日本)溅射镀金。用扫描电镜(TESCAN VEGA3，捷克共和国)观察细胞簇表面形态。

透射电子显微镜(TEM)

用透射电镜观察CRPC的微观结构。收集细胞样本进行扫描电镜分析。细胞的消化和离心过程与细胞培养过程相同。标本用3%戊二醛固定，加入1%氧化锇缓冲液。在一系列分级乙醇中脱水(30,50,70,80,90,95和100%)。然后，对样品进行丙酮置换醇、环氧树脂渗透、催化剂聚合、超薄切片等处理。透射电镜(H-7650, HTACHI, Japan)观察标本，记录图像，放大倍数为10000倍。

酶联免疫吸附试验(ELISA)

ELISA试剂盒检测血清中PSA的表达。根据ELISA试剂盒(Human PSA ELISA kit, mlbio, Shanghai, China)，离心管收集各组上清。用分光光度计(EPOCH3, BioTek, USA)测定每孔的光密度(OD)。KIT标准样品建立标准曲线。用标准曲线计算三次相应的样品浓度。

统计分析

所有数据分析均使用GraphPad Prism 8 for Windows (version 8.2.1, GraphPad Software, San Diego, California USA)进行。www.graphpad.com）.所有数据均以均数±标准差表示，并采用学生t检验、单因素方差分析或双因素方差分析进行比较。组间测量数据比较采用Bonferroni检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

细胞培养形态

与Lncap-AD细胞株的形态相比，Lncap-AI细胞株的形态发生了变化，每10代的形态如图所示。1a .特别是在传代60中，雄激素剥夺和氟他胺作用下细胞形态变化更明显，细胞间变细，细胞间空隙增大。然后用HE染色进一步观察Lncap-AI细胞株的形态。Lncap-AD细胞株到Lncap-AI细胞株的形态变化如图所示。1B.此外，PC3细胞株形态染色为雄激素非依赖性阳性细胞株。因此，在HE染色中，Lncap-AI细胞株的形态与Lncap-AD细胞株不同，与PC3细胞株相似。

Lncap-AI细胞系的鉴定

为了鉴定形成的Lncap-AI细胞系，采用qRT-PCR和WB法检测AR mRNA和蛋白水平。在mRNA水平上，AR及其相关信号通路(FKBP5和STEAP1)在Lncap-AI细胞系中的表达明显高于Lncap-AD细胞系(图2)。2A)。AR蛋白在Lncap-AI细胞系中的表达水平低于Lncap-AD细胞系(图2)。2此外，通过检测PSA蛋白表达，观察三种前列腺细胞的功能，Lncap-AI细胞系的PSA蛋白表达高于Lncap-AD细胞系(图2)。2B).这些结果表明我们的方法能够形成Lncap-AI细胞系。PSA分泌是Lncap-AI细胞系的另一项重要检测。在分泌蛋白水平上，我们选择PSA来研究Lncap-AI细胞系的分泌能力。在Elisa测试中，Lncap-AI细胞系的差异显示Lncap-AD细胞系与PC3细胞系之间无显著差异(图2)。2C)。对LncapAD和LncapAI细胞系进行Western blotting分析，检测AR途径蛋白的影响，分别检测AR和HK2(图2)。2D). AR信号抑制剂Enzalutamide能影响和下调LncapAD细胞株中AR和HK2蛋白的表达，但在LncapAI细胞株中无差异。这些结果表明，我们的方法能够形成Lncap-AI细胞系，并且与Lncap-AD细胞系相比，对AR反应的敏感性较低。

Lncap-AI细胞系的细胞功能

Lncap-AI细胞系的增殖能力

EdU法进一步观察Lncap-AI细胞株的增殖能力及生物学功能。结果表明，与Lncap-AD细胞系相比，Lncap-AI细胞系的增殖能力有所提高(图2)。3.一个)。

用CCK8试剂盒孵育CRPC细胞(Lncap-AD、Lncap-AI和PC3)，在初始细胞浓度相同的情况下进行分析，第5天PC3细胞的增殖能力较高，Lncap-AI细胞株的增殖能力次之，Lncap-AD细胞株的增殖能力较弱。与Lncap-AD细胞系相比，PC3和Lncap-AI细胞系表现出显著的生命差异(图2)。3.B)。

Lncap-AI细胞系的迁移能力

CRPC细胞(Lncap-AD、Lncap-AI和PC3)的迁移抗性通过伤口愈合试验进行评估。由此可见，与Lncap-AD细胞系相比，Lncap-AI细胞系的迁移距离明显更远(图2)。3.C)。

Lncap-AI细胞株的粘附能力

采用粘附法观察前列腺癌细胞(Lncap-AD、Lncap-AI、PC3)的粘附能力。与Lncap-AD细胞系相比，Lncap-AI细胞系表现出明显稳定的生长能力(图2)。3.D).在CCLE数据库中，从KEGG中选择了26个细胞粘附信号基因。通过CCLE数据库进一步检测它们(图2)。3.E).选择Lncap与PC3之间表达不同的6个基因(ICAM2、LICAM、A1CAM、MCAM、LCAM1、ESAM)，进一步进行qRT-PCR检测。与Lncap-AD细胞系相比，MCAM (p< 0.001)， icam1 (p< 0.001)， L1CAM和A1CAM在Lncap-AI和PC3细胞系中mRNA水平过表达(图2)。3.F)。

Lncap-AI细胞系的膜观察

采用扫描电镜(SEM)技术获得了CRPC细胞的细胞膜。Lncap-AI细胞系的细胞膜较Lncap-AD细胞系粗糙。PC3细胞系的表面不是非常光滑(图2)。4A).细胞表面的平滑度可能与细胞粘附能力成反比。细胞表面越光滑，粘附能力越差。

采用透射电镜(TEM)技术观察了CRPC细胞的微观结构。电镜下观察到多发假足。Lncap-AI细胞系的假足比Lncap-AD细胞系的假足多。PC3细胞系具有大量的假足(图3)。4B).假足数量的不同可能是导致细胞粘附能力差异的因素。

去势抵抗性前列腺癌(CRPC)是世界范围内最致命的恶性肿瘤之一，其预后差，易扩散到其他器官。Lncap-AI是一种潜在的前列腺癌(PCa)亚系模型，用于研究CRPC并刺激疾病的进展。在过去的十年里，Lncap-AI的建立仍在继续。雄性激素去势环境下Lncap细胞系逐渐向Lncap- ai细胞系转移[4]。大多数研究者采用雄激素去势法和长时间培养获得Lncap-AI细胞系，该细胞系适应剥夺雄激素的环境，能够克隆增殖。该协议已在我们建立的过程中使用，并做了一些改进。氟他胺是一种非甾体雄激素拮抗剂，与雄激素竞争雄激素受体。它将它们结合成一个主体复合物，该主体复合物进入细胞核并附着在核蛋白上，从而抑制雄激素与雄激素的结合。因此，雄激素剥夺疗法(ADT)和氟他胺可抑制Lncap-AD细胞株雄激素的合成和分泌。

在早期阶段，Lncap-AD细胞呈球形，扩大并聚集成簇。加入氟他胺并在雄激素剥夺条件下培养后，细胞形态变细，细胞间空隙增大。细胞形态细节如图所示。1。HE染色清除形态，显示前列腺癌细胞(Lncap-AD、Lncap-AI、PC3)之间的差异。Lncap-AD是一种天然雄激素依赖性细胞系，其特征很容易聚集成一个簇，并呈现球形形态。与Lncap-AD不同的是，Lncap-AI细胞系在细胞之间呈现出明显的空间，并且形态转向拉长的形状。原生雄激素非依赖性细胞系PC3显示出单独的形状。球形和细长型都可以观察到。细胞形态细节如图所示。1。这种改进的培养措施可以帮助我们获得更稳定、更高效的Lncap-AI子链。与LncapAD细胞株相比，LncapAI细胞株在mRNA和蛋白水平上的AR表达均上调。作为雄激素抗性细胞系，LncapAI细胞系对AR信号抑制剂Entrizatimide反应较差。2。这些改良的培养和AR表达差异测量可以帮助我们获得更稳定和高效的Lncap-AI亚型。

CRPC在宏伟的过程中受到生命的威胁，包括扩散[13]，细胞凋亡[14，15]，细胞周期[16]、迁徙和入侵等。然而，关于细胞粘附与其他生物学行为(包括迁移、侵袭、EMT和转移)之间关系的报道较少。只有倪洁等研究人员。[17上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)在前列腺癌的增殖、侵袭、转移和化疗/放疗耐药过程中起着至关重要的作用。常用的雄激素非依赖性前列腺癌细胞系包括PC3 [18，19，20.]和DU145 [21]。我们的研究发现Lncap-AI细胞系比Lncap-AD细胞系具有更多的增殖、迁移和细胞粘附能力，并且在图中CRPC阳性细胞系pc3内具有相同的趋势。3.。

此外，MCAM(细胞表面糖蛋白MUC18)、L1CAM(神经细胞粘附分子L1)、ICAM1(细胞间粘附分子1)和ALCAM (CD166抗原)在CRPC细胞系中表达水平相同。MCAM在细胞粘附中起重要作用，特别是在促进血行性肿瘤扩散方面[22]。L1CAM与神经细胞粘附分子有关，可能涉及细胞粘附和酪氨酸激酶受体的跨膜信号[23]。在白细胞跨内皮迁移期间，ICAM1可促进内皮顶杯组装[24]。ALCAM通过抑制内皮细胞迁移促进内皮管形成[25]。这些细胞黏附相关基因均在CRPC细胞系间发挥作用。然而，在蛋白水平上的研究还需要进一步的探索，以确认图中细胞粘附功能。3.。

此外，一些形态学技术已被用于探索细胞粘附的生物学行为，如显微镜、扫描电镜、透射电镜和细胞粘附实验。我们研究了前列腺癌细胞(Lncap-AD)暴露于雄激素剥夺和氟他胺后细胞形态的变化。持续培养10 ~ 60代时，Lncap细胞形态发生明显变化。以上方法均能明显观察到Lncap-AI和Lncap-AD细胞系的形态学差异，如图所示。4。这些结果表明我们建立的Lncap-AI细胞系过程与CRPC细胞模型具有相同的趋势。

另一个重要的评价指标是PSA分泌能力[26，27]。在临床研究中，PSA和AR能力被用来检测前列腺癌患者[28]。众所周知，AR在细胞核内形成，并向细胞质表达[29]。在Lncap-AI细胞系中，AR在细胞核(mRNA水平)和细胞质(蛋白水平)中表达较高。我们的结果符合这一原则。此外，AR信号通路相关基因包括FKBP5 [30.]及STEAP1 [31]，在Lncap-AI和Lncap-AD细胞系中也显示出很强的差异。同样，这种差异与PC3细胞系相匹配，如图所示。3.。

检测PSA蛋白，观察CRPC细胞株恶性前列腺癌的发生。结果显示，Lncap-AI细胞株中PSA的表达高于Lncap-AD细胞株。这些发现表明我们建立的Lncap-AI细胞系过程具有分泌PSA的能力。虽然我们的研究为证明Lncap-AI细胞系提供了方便的方案，但仍需要进一步的研究来探索细胞粘附的机制，如图2所示。2C。

综上所述，本研究可在氟他胺和雄激素剥夺条件下建立稳定的Lncap-AI细胞系。细胞亚系的建立可以模拟临床治疗过程:前列腺癌从雄激素依赖状态转变为雄激素独立状态。细胞的粘附能力在转移功能的建立中起着重要的作用。

本研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章中。

ADT:

雄激素剥夺疗法

CCK8:

细胞计数试剂盒-8

CRPC:

去势抵抗性前列腺癌

EdU试验:

5-ethynyl-2脱氧尿苷的测定

的边后卫:

胎牛血清

GAPDH:

Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶

Lncap-AD:

Lncap androgen-dependent

Lncap-AI:

Lncap androgen-independent

OD:

光密度

主成分分析:

前列腺癌

PSA值:

前列腺特异性抗原

存在:

定量实时聚合酶链反应

扫描电镜:

扫描电子显微镜

透射电镜:

透射电子显微镜

我们感谢中国广西基因组与个性化医学中心的支持。

国家自然科学基金(8216110292)、广西中西医结合治疗高发感染性疾病转化医学重点实验室开放项目(gxgcop2 -2020-2)和广西医科大学优秀青年人才培养计划资助。

作者指出

1. 王慧峰和魏希华对这项工作的贡献相同。

作者及单位

1. 广西医科大学基础医学院人体解剖教研室，广西南宁530021

   汇丰王

2. 广西医科大学广西壮族自治区教育厅人类发展与疾病研究重点实验室，广西南宁530021

   汇丰王

3. 广西医科大学生命科学研究所，广西南宁530021

   魏西华，李卫东，胡艳玲

4. 广西医科大学省部共建再生医学与医用生物资源开发与应用协同创新中心，广西南宁530021

   张死

贡献

YLH和HFW构思和设计了该项目。HFW生成了图表。XHW、DZ、WDL进行表达分析。所有的作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到陵胡。

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者声明无利益冲突。

出版商的注意

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