对乙酰氨基酚改变了RNA⁶A - levels和m - level⁶il -1β处理的软骨细胞中a相关蛋白表达

背景

对乙酰氨基酚通常被推荐用于骨关节炎的早期镇痛。然而，其作用的分子机制尚不清楚。本研究旨在探讨对乙酰氨基酚对人软骨细胞炎症和细胞外基质降解的影响及其可能的分子机制。

方法

用白细胞介素-1β处理正常软骨细胞系C28/I2，模拟炎症状态。用对乙酰氨基酚和甲基化抑制剂环亮氨酸治疗白介素-1β诱导的C28/I2细胞。RNA N的表达⁶RT-qPCR和western blot检测-甲基腺苷相关蛋白。总RNA N⁶采用点印迹法和酶联免疫吸附法测定-甲基腺苷水平。采用酶联免疫吸附法检测大鼠血清白细胞介素-6、白细胞介素-8及抗肿瘤坏死因子-α水平。western blot检测细胞外基质的合成和降解情况。

结果

白细胞介素-1β刺激C28/I2细胞后，细胞内RNA N⁶-甲基腺苷水平升高，调节蛋白表达也发生变化，主要表现为甲基转移酶3等表达增加，AlkB家族成员5表达下调。环亮氨酸通过抑制RNA N抑制白细胞介素-1β诱导的炎症和细胞外基质降解⁶-methyladenosine修改。相反，对乙酰氨基酚治疗抵消了白介素-1β-诱导的RNA N的变化⁶-甲基腺苷水平和调节蛋白表达。此外，对乙酰氨基酚处理白细胞介素-1β诱导的C28/I2细胞可抑制白细胞介素-6、白细胞介素-8和抗肿瘤坏死因子-α的分泌，下调基质金属蛋白酶-13和胶原X的表达，上调胶原II和聚集蛋白的表达。此外，AlkB家族成员5过表达激活白细胞介素-1β诱导的软骨细胞活力，抑制炎症和细胞外基质降解。

结论

对乙酰氨基酚通过调节RNA N影响人软骨细胞炎症因子分泌和细胞外基质合成⁶-甲基腺苷水平和N⁶-甲基腺苷相关蛋白表达。

图形抽象

细胞因子IL-1β (10 μM)刺激正常软骨细胞系C28/I2模拟体外炎症状态。对乙酰氨基酚(Ace, 50 μg/mL)可改变m⁶A相关蛋白的表达与总RNA的表达⁶il -1β处理的软骨细胞A水平。此外，RNA m的调控⁶A水平(通过甲基化抑制剂Cyc和/或Ace)影响il -1β诱导的炎症细胞因子分泌和C28/I2细胞外基质合成。

骨关节炎(OA)是一种普遍的退行性和慢性炎症性关节疾病，是全球三大致残原因之一，影响全球超过2.5亿人[1，2]。由于老龄化和肥胖/超重人口的增加，OA将变得更加普遍。联合国估计，到2050年，约有15-20%的人口会患上OA，其中三分之一将无法进行日常活动[3.]。OA的研究需要更多的关注。

目前OA的临床治疗包括非药物治疗、药物治疗和手术治疗，必要时联合使用。但这些方法旨在缓解疼痛和减缓疾病进展，并不能逆转或实际上治疗OA。非药物治疗指的是改变生活方式，通过改变饮食、锻炼、减肥等方式促进健康的身体组成。非药物选择往往未得到充分利用。在过去的几十年里，药理学的选择并没有显著的改善。疾病初期的药物治疗主要包括对乙酰氨基酚(Ace、扑热息痛)、非甾体类抗炎药(NSAIDs)、阿片类药物。然而，非甾体抗炎药可能引起胃肠道和心血管并发症。阿片类药物有成瘾性限制。当骨性关节炎恶化时，可以使用关节内皮质类固醇来抑制疼痛和炎症，尽管它们的作用通常是短期的。大多数皮质类固醇是疏水性的，半衰期短，在关节中的保留时间不足。 However, long-term use of corticosteroids should be avoided, with adverse effects including immunosuppression, osteoporosis, and diabetes. Furthermore, the role of nutritional supplements such as chondroitin sulfate in improving OA pain and inflammation is controversial [4]。关节置换手术是最后一种选择，而且更昂贵。此外，制药公司的新发展方向主要包括OA类疾病改善药物、纳米药物等，这些药物尚未显示出良好的疗效[5]。总的来说，在过去的几十年里，OA的临床治疗没有明显的进展，迫切需要突破。

Ace于1878年首次由其前体非那西丁合成。20世纪50年代，Ace作为一种比非那西丁更安全的替代品上市，后者被发现具有肾毒性和潜在致癌性。在20世纪80年代，Ace开始逐渐取代阿司匹林，成为使用最广泛的非处方止痛药。目前，Ace仍是世界上最常用的镇痛解热药之一，被世界卫生组织列入《基本药物清单》[2，6]。由于相信Ace的相对安全性和缺乏合适的替代品，特别是考虑到非甾体抗炎药和阿片类药物的安全性，Ace被推荐作为OA和腰痛等慢性疾病的一线治疗方法[7，8]。目前，Ace的作用机制尚不完全清楚，可能与抑制环氧化酶-2有关[9]。因此，有必要探讨Ace对OA作用的分子机制。

RNA甲基化是维持RNA代谢和功能所必需的，参与了人类发育和疾病的整个过程[10]。N⁶-methyladenosine (m⁶A)占RNA甲基化修饰的80%，是真核生物中常见的RNA修饰。米⁶A是由m安装的⁶甲基转移酶复合物(METTL3和METTL14)及其辅助因子(WTAP, RBM15/15B, ZC3H13和VIRMA)被FTO和ALKBH5去除[11]，并被RNA结合蛋白识别以执行特定的生物学功能，包括YTHDC1/2、YTHDF1/2/3、HNRNPA2/B1、IGF2BP1/2/3和Prrc2a [12，13，14]。最近的研究表明，m⁶A甲基化水平和METTL3表达在退行性软骨组织中显著升高[15]。RNA m的变化⁶各种基因的修饰调节其表达水平并参与OA的生物学过程，如软骨细胞合成细胞外基质(ECM) [15，16，17，18]。

本研究以白细胞介素(IL)-1β处理的人软骨细胞株C28/I2为研究对象，分析Ace对RNA - m的影响⁶IL-1β对C28/I2细胞的修饰及其是否通过调节RNA m影响炎症因子分泌和ECM合成⁶一个修改。然而，本研究并未揭示Ace调控RNA m差异表达的具体分子机制⁶一种修饰相关的蛋白质。

细胞培养和处理

人正常软骨细胞系C28/I2购自北京北纳创联生物技术研究所(北京，中国)，在添加10% (v/v) FBS (A31608, GIBCO)的DMEM/F12培养基中(1:1比例)，37℃，5% CO保存₂．IL-1β (10 μM) (SRP3083)、Ace (50 μg/mL)和环赖氨酸(A48105) (Cyc, 20 μM)购自Sigma Aldrich，作用细胞12 h。ALKBH5的编码序列由Genechem (Shanghai, China)合成，克隆到pcDNA3.1表达载体上，用Lipofectamine 2000试剂(11668-019,Invitrogen)转染到细胞中。

定量rt - pcr

用Trizol试剂提取细胞总RNA。分光光度计定量后，使用PrimeScript RT Master Mix (CW2569M, CWBIO, China)将等量RNA反转录为cDNA。目的基因采用SYBR Green Real-time PCR Master Mix (CW0957H, CWBIO)进行扩增。计算METTL3、METTL14、WTAP、RBM15/15B、ZC3H13、VIRMA、FTO、ALKBH5、YTHDC1/2、YTHDF1/2、HNRNPA2/B1、IGF2BP1/2/3、Prrc2a基因的相对表达量^-△Ct方法，以GADPH相对水平为对照。

免疫印迹

用冷冻RIPA裂解缓冲液(CW2333S, CWBIO)提取细胞总蛋白。用BCA试剂盒(CW0014S, CWBIO)定量后，用SDS-PAGE凝胶电泳分离等量的总蛋白，并转移到PVDF膜(ISEQ00010, Millipore, USA)上。用5%脱脂乳阻断后，膜与抗ALKBH5 (1:2000, ab195377, Abcam)、FTO (1:1000, ab126605, Abcam)、Aggrecan (1:2000, ab36861, Abcam)、Collagen X (1:2000, ab58632, Abcam)、MMP13 (1:1000, ab39012, Abcam)或Collagen II (1:2000, Abcam)的一抗在4℃孵育过夜，然后与山根标记的二抗(SA00001, PTG)在室温孵育2小时。用ECL (PK10002, PTG)处理膜进行波段显示。

米总⁶A电平检测

采用TRIzol试剂对总RNA进行分离纯化。总RNA在紫外光下变性，并与优化后的Amersham Hybond-N交联⁺膜。交联后，用5%脱脂牛奶封膜，用anti-m孵育⁶抗体在4°C下过夜。Immobilon Western Chemilum HRP底物(Merck Millipore)用于可视化。ELISA使用EpiQuik m6A RNA甲基化定量酶联免疫吸附测定试剂盒(P-9005-96, Epigentek)。

ELISA法检测炎症因子

ELISA法检测各组细胞因子(IL-6、IL-8、TNF-α)水平(EH2IL6、KHC0081、KHC3011;根据制造商的说明。

CCK-8法测定细胞活力

用pcDNA 3.1-ALKBH5表达质粒转染细胞，IL-1β处理12 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，37℃孵育2 h。450 nm处的吸光值用酶标仪(BioTek Instruments, USA)测量。

统计分析

数据采用SPSS 20.0进行统计学分析，以mean±SD表示。组间显著性差异分析采用单向方差或t检验。P< 0.05有显著性意义。

a改变m⁶A - levels和m - level⁶il -1β处理的软骨细胞中相关蛋白表达

CTD资料库(http://ctdbase.org/)假定OA中的Ace应用程序将与这些m交互⁶a相关蛋白(表1)。细胞因子IL-1β (10 μM)刺激正常软骨细胞系C28/I2模拟体外炎症状态。通过ELISA检测培养基中基质金属肽酶(MMP)-13水平，证实炎症状态。1)。用50 μg/mL的Ace (IL-1β + Ace)处理IL-1β诱导的C28/I2细胞。孵育12 h后，m⁶a相关蛋白和总m⁶检测各组A水平(图2)。1a - c)。如图所示。1A、与NC组比较，IL-1β组METTL3、WTAP、RBM15、RBM15B、ZC3H13、YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2、HNRNPA2、HNRNPB1、IGF2BP1、IGF2BP2、PRRC2A mRNA水平显著升高，而IL-1β + Ace组这些蛋白mRNA水平较IL-1β组明显降低。此外，与NC组相比，IL-1β组ALKBH5 mRNA和蛋白水平降低，而IL-1β + Ace组ALKBH5 mRNA和蛋白水平恢复(图2)。1然而，METTL14、VIRMA和FTO的mRNA水平没有显著变化(图2)。1A和B)。此外，与NC组相比，总m⁶IL-1β组A水平升高，经Ace治疗后恢复正常(图2)。1C和D)。

RNA m的调控⁶A水平影响il -1β诱导的C28/I2细胞炎症因子分泌和ECM合成

鉴于IL-1β和/或Ace治疗对m⁶我们对C28/I2细胞进行了修饰，使用甲基化抑制剂Cyc进行了验证实验。如图所示。2A和B, Cyc (10 μM)处理降低了总m⁶A水平il -1β诱导C28/I2细胞，Cyc和Ace具有协同作用。此外，Cyc和Ace单独治疗可降低炎症细胞因子(IL-6、IL-8和TNF-α)的分泌，下调MMP-13和Collagen X的表达，上调Collagen II和Aggrecan的表达，这些均受IL-1β的调节(图1)。2一部)。这些结果提示RNA m的调控⁶A水平影响il -1β诱导的C28/I2细胞炎症因子分泌和ECM合成。

ALKBH5过表达影响il -1β诱导的C28/I2细胞活力、炎症因子分泌和ECM合成

鉴于ALKBH5在il -1β诱导的C28/I2细胞Ace治疗中的独特作用，我们检测了ALKBH5过表达对il -1β诱导的C28/I2细胞活力、炎症因子分泌和ECM合成的影响。如图所示。3.A和B，转染pcDNA 3.1-ALKBH5表达质粒上调NC和il -1β诱导的C28/I2细胞中ALKBH5蛋白的表达。过表达ALKBH5可提高il -1β诱导的C28/I2细胞的活力，对NC细胞的活力无显著影响(图2)。3.此外，在il -1β诱导的C28/I2细胞中，过表达ALKBH5可抑制炎症因子(IL-6、IL-8和TNF-α)的分泌，下调MMP-13和Collagen X的表达，上调Collagen II和Aggrecan的表达(图1)。3.D-F)。

近年来，Ace治疗慢性疾病的益处受到质疑。几项随机对照试验发现Ace与安慰剂在治疗OA疼痛方面有统计学差异，但止痛效果中等[19]。在同一时期，对长期使用Ace的不良反应的担忧也有所增加，主要不良反应包括胃肠道出血风险增加和收缩压小幅升高[8，20.，21]。然而，在没有合适的替代药物的情况下，Ace仍被广泛推荐用于OA的早期镇痛治疗，并经常被开处方[7，22，23]。此外，Ace在OA治疗中的分子机制尚不清楚。因此，有必要探讨Ace对OA作用的分子和药理学机制，为Ace的应用指导提供一定的依据。

骨性关节炎被认为是软骨变性。其主要发病机制之一是促炎细胞因子激活分解代谢酶(如MMP13)，进而损伤软骨和其他关节内结构[24]。IL-1β在OA进展中起关键作用。它可以激活不同的信号通路，诱导其他炎性细胞因子(如IL-6、IL-8、TNF-α)和MMPs的产生，诱导软骨降解[25]。这种组合导致OA的进展。成人关节软骨的细胞外骨架是聚集的胶原蛋白，胶原II是其主要的分子成分[26]。X胶原蛋白通常局限于连接关节软骨和骨的钙化软骨的薄层，在OA病变中表达和沉积[27]。本研究发现，Ace处理il -1β诱导的C28/I2细胞可抑制IL-6、IL-8和TNF-α的分泌，下调MMP-13和Collagen X的表达，上调Collagen II和Aggrecan的表达(图1)。2)。这些体外细胞实验的结果表明，Ace治疗可以抑制人软骨细胞的炎症反应和ECM降解，似乎表明Ace在OA进展中的药理作用，但缺乏令人信服的动物和/或人体研究。

此外，最近的报道表明，RNA是一种具有特异性的RNA⁶一个修饰过程通过调节多个靶基因的mRNA稳定性和表达参与OA的进展[28，29]。本研究结果表明，IL-1β刺激C28/I2细胞，增加RNA m⁶A水平及调控蛋白表达变化，主要表现为METTL3表达增加，ALKBH5表达下调(图2)。1)。RNA的使用⁶一种抑制剂Cyc也提示了RNA m的关键作用⁶骨性关节炎进展中炎症和ECM降解的修饰过程(图2)。2)。与我们的研究一致，有报道称细胞内RNA m⁶IL-1β刺激软骨祖细胞系ATDC5细胞后，A水平和METTL3表达增加[30.]。METTL3表达和RNA m显著升高⁶在退行性软骨组织中也有A水平的报道[15]。相比之下，一项研究分析了18rna m的表达模式⁶本研究在18个正常软骨组织和20个OA软骨组织中发现A -修饰蛋白[31]。这项研究的结果与我们的不一样。然而，两组患者样本的性别和年龄存在显著差异[32]。正常软骨取自5名女性和13名男性，平均年龄38岁(18-61岁)，在患者死亡24小时后采集。OA软骨样本来自12名女性和8名男性，平均年龄为66岁(52-82岁)。众所周知，OA是一种与年龄、性别密切相关的疾病。这可能是两项研究结果不同的主要原因。至关重要的是，本研究发现Ace治疗可抵消il -1β诱导的RNA m变化⁶A水平和调节蛋白表达(图2)1)。

最后，作为一种甲基化酶，METTL3在OA进展中有一定的研究。然而，作为一种主要的去甲基化酶，ALKBH5在OA进展中的作用尚未得到充分研究。本研究首次证明ALKBH5过表达激活il -1β诱导的软骨细胞活力，抑制炎症和ECM降解。然而，作为一种去甲基化酶，FTO在IL-1β和Ace治疗下均无显著变化。我们对此缺乏研究和解释。

首先，本研究的数据，以及其他研究报告，表明RNA m的差异表达⁶a相关蛋白和总RNA水平升高⁶A参与OA的进展。总RNA m⁶一种修饰性改变调节下游靶基因的表达，其在OA进展中的作用仍需进一步研究。是否有可能设计基于RNA的药物⁶A相关蛋白和/或总RNA⁶A水平延迟骨性关节炎进展也需要更多的基础研究作为数据支持。此外，Ace处理能够影响RNA m的表达⁶软骨细胞中a相关蛋白及总RNA的表达⁶一个水平。然而，本研究并未揭示Ace作用的具体机制。最后，Ace在体外可抑制il -1β处理的人软骨细胞的炎症反应和ECM降解，提示Ace的药理作用。然而，需要更有说服力的动物和/或人类研究。

本研究过程中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章中。

办公自动化:

骨关节炎

米⁶答:

N⁶-methyladenosine

METTL3:

甲基转移酶，比如3

METTL14:

甲基转移酶，比如14

WTAP:

Wilms肿瘤1相关蛋白

RBM15/15B:

RNA结合基序蛋白15/15B

ZC3H13:

锌指型含ccch 13

VIRMA:

你和我一样⁶甲基转移酶相关

FTO:

脂肪量与肥胖有关

ALKBH5:

AlkB家庭成员

YTHDC1/2:

包含1/2的YTH域

YTHDF1/2/3:

YTH N (⁶)-甲基腺苷RNA结合蛋白1/2/3

HNRNPA2 / B1:

异质核糖核蛋白A2/B1

IGF2BP1/2/3:

胰岛素样生长因子2mrna结合蛋白1/2/3

Prrc2a:

富含脯氨酸的线圈2A

ECM:

细胞外基质

赛:

Cycloleucine

IL:

白介素

肿瘤坏死因子-α:

肿瘤坏死因子-α

MMP-13:

基质金属肽酶

不适用。

作者声明在撰写本文期间未收到任何资金、资助或其他支持。

作者及单位

1. 250022，山东省济南市淮阴区端兴西路4号，山东省第二总医院关节外科

   高杰，李艳，刘紫金，王东，张华武

贡献

所有作者都对研究的构思和设计做出了贡献。材料准备、数据收集和分析由高洁、李燕完成。手稿的初稿由张华武撰写，所有作者都对以前的手稿版本进行了评论。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到华武张．

伦理批准并同意参与

本研究方案经山东省第二总医院研究伦理委员会批准。所有实验方法均按照相关指南和规定进行。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者没有相关的财务或非经济利益需要披露。

出版商的注意

伟德体育在线施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。

开放获取本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，该协议允许以任何媒介或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要您适当地注明原作者和来源，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否进行了更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的知识共享许可协议中，除非在材料的署名中另有说明。如果材料未包含在文章的知识共享许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超过允许的用途，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．创作共用公共领域免责声明(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本文中提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。

转载及权限