生长激素/雌激素/雄激素对正常人肺上皮BEAS-2B细胞covid -19型促炎反应的影响

背景

COVID-19是一种由SARS-CoV-2引起的疾病，可在人类中引起轻度至重度感染。我们旨在探讨正常人肺上皮BEAS-2B细胞中生长激素(GH)/雌激素/雄激素对covid -19型促炎反应的影响。

方法

构建BEAS-2B型covid -19样促炎细胞模型。然后用生长激素、17β-雌二醇(E2)和睾酮(Tes)处理细胞24小时。用CCK-8测定细胞活力。mRNA的表达ACE2，AGTR1，TMRRSS2,ISG15采用qRT-PCR和Western blotting分别检测ACE2、AGTR1、TMRRSS2和ISG15蛋白的表达。elisa检测IL-6、MCP-1、MDA、SOD的表达。流式细胞术检测ROS水平。最后评估MAPK/NF-κB通路相关因子的表达。

结果

成功构建covid -19型促炎模型，选择1000 ng/mL RBD处理24 h作为模型组进行后续实验的条件。RBD处理后，细胞活力下降，mRNA表达ACE2，AGTR1，TMRRSS2,ISG15ACE2、AGTR1、TMRRSS2、ISG15蛋白表达升高，IL-6、MCP-1、MDA、ROS水平升高，MDA水平降低。细胞的mRNA水平MAPK14和RELA增加，但蛋白质水平没有显著变化。此外，磷酸化mapk14和磷酸化rela蛋白水平也有所升高。在测试的分子中，E2的作用最显著，其次是GH，而Tes的作用相反。

结论

在covid -19型促炎模型中，GH/E2可缓解炎症，而Tes则相反。

由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)引起的2019冠状病毒病(COVID-19)大流行，对全球公共卫生构成严重威胁[1]。SARS-CoV-2通常通过呼吸道飞沫传播。平均潜伏期为6.4天;大多数患者症状轻微，少数患者出现严重缺氧，需要住院并机械通气[2]。年龄、性别、肥胖和吸烟以及疾病状态相关受体表达的改变可能与COVID-19的发病率和严重程度相关[3.]。临床资料表明，成人感染SARS-CoV-2通常比儿童更严重[4]。据推测，儿童临床严重程度较低可能与SARS-CoV-2主要宿主功能受体血管紧张素转换酶2 (ACE2)的差异表达有关，但数据仍存在矛盾[4]。SARS-CoV-2通过ACE2进入宿主细胞，ACE2在心脏、肾脏和肺中高度表达并进入血浆[qh]5]。与女性相比，男性的COVID-19发病率、严重程度和死亡率更高[6]，但造成这种性别差异的潜在因素仍在研究中。

生长激素(GH)和性激素水平的差异是儿童和成人之间最显著的差异之一。雌激素和雄激素可能与ACE2的表达密切相关[7]。新出现的证据表明，该病毒还以表达ACE2(其主要受体)的男性和女性生殖器官为目标[8]。性类固醇(尤其是女性)和生长激素(两者在免疫调节中起关键作用)的减少是老年人SARS-CoV-2严重程度的关键因素[9]。胰岛素样生长因子-1 (IGF1)通过控制内分泌系统影响免疫系统[10]。低IGF1(可能还有GH)与COVID-19患者预后不良可能存在关联[11]。有明确证据表明，免疫系统失调是决定SARS-CoV-2严重程度及其与成人发病的生长激素缺乏症相关性的关键因素[12]。Galganska H等报道，SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合域刺激了covid -19样促炎反应[13]。此外，睾酮(Tes)、生长激素和雌激素均与TLR4炎症通路相关[14，15，16]。然而，生长激素/雌激素/雄激素对covid -19型促炎反应的影响尚不清楚。

因此，基于上述背景，我们希望研究BEAS-2B细胞GH/雌激素/雄激素对covid -19型促炎反应的影响。我们的研究可能为COVID-19的防治提供新的思路和参考。

细胞治疗

正常人肺上皮BEAS-2B细胞由BLUEFBIO公司(BFN608009328，中国)提供，在含10%胎牛血清和1%双抗生素的DMEM高糖培养基中培养。构建covid -19型促炎细胞模型[13，17，18]，将细胞分为对照组(正常培养细胞+溶剂对照12和24 h)、RBD-500组(500 ng/mL重组SARS-CoV-2刺突RBD蛋白带His标签(RBD)处理BEAS-2B细胞12和24 h)和RBD-1000组(1000 ng/mL RBD处理BEAS-2B细胞12和24 h)。将细胞进一步分为对照组(正常培养细胞+溶剂对照处理24 h)、RBD组(1000 ng/mL RBD处理24 h)、RBD + GH组(1000 ng/mL RBD和200 ng/mL GH同时处理24 h)、RBD + E2组(1000 ng/mL RBD和1 nM 17β-雌二醇(E2)同时处理24 h) [6])， RBD + Tes组(1000 ng/mL RBD和10 nM Tes同时处理24 h [6])。

细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)测定

将不同组的BEAS-2B细胞消化、计数后以1 × 10的密度接种于96孔板中⁴细胞/孔，每孔加100µL。细胞计数试验在重复中进行。每组设3个重复孔。贴壁细胞培养后，加入10µL/孔的CCK-8 (#NU679, DOJINDO, Japan)，用完全培养基配制CCK-8溶液。37°C和5% CO孵育后₂，在Bio-Tek酶标仪上分析450nm处的吸光度值。

实时定量PCR (qRT-PCR)

用TRIzol (#15596026, Thermo, USA)提取总RNA，用cDNA逆转录试剂盒(#CW2569, Beijing ComWin Biotech, China)反转录成cDNA。随后，在荧光定量PCR仪(QuantStudio1, Thermo, USA)上使用Ultra SYBR混合物(#CW2601, Beijing ComWin Biotech, China)进行实时PCR。反应体系为30µL，包括2µL逆转录产物cDNA, 1µL Primer R(10µM)， 1µL Primer F(10µM)， 11µL ddH₂O, 15µL 2xsybr Green PCR Master Mix。反应条件为:95℃预变性10 min, 95℃变性15 s, 60℃退火30 s，共40次循环。这个实验重复了三次。以ACTB为内参基因，采用2^−ΔΔCt方法,△△Ct =△Ct实验组△对照组△Ct = Ct(靶基因)-Ct(内参基因)。引物序列如下:ACE2- f: 5“-GGACACTGAGCTCGCTTCTG-3”,ACE2- r: 5“-CCTTTGAACTTGGGTTGGGC-3”;AGTR1- f: 5“-CGGGGCGCGGGTTTG-3”,AGTR1- r: 5“-TACACCTGGTGCCGACTTTC-3”;TMPRSS2- f: 5“-ATACAAGCTGGGGTTCTGGC-3”,TMPRSS2- r: 5“-TAGCCGTCTGCCCTCATTTG-3”;ISG15- f: 5“-GGTGGACAAATGCGACGAAC-3”,ISG15- r: 5“-TCGAAGGTCAGCCAGAACAG-3”;MAPK14- f: 5“-ACAGGATGCCAAGCCATGAG-3”,MAPK14- r: 5“-GATCGGCCACTGGTTCATCA-3”;RELA- f: 5“-CGCCTGTCCTTTCTCATCCCAT-3”,RELA- r: 5“-CCTCTTTCTGCACCTTGTCACAC-3”;ACTB- f: 5“-ACCCTGAAGTACCCCATCGAG-3”,ACTB- r: 5“-AGCACAGCCTGGATAGCAAC-3”。

西方墨点法

从5.3 × 10中提取总蛋白⁶BEAS-2B细胞使用RIPA试剂盒(P0013B, Beyotime, China)。确定蛋白浓度后，用10% SDS-PAGE电泳分离蛋白。蛋白质通过电转移转移到PVDF膜上。对于一抗，我们使用了抗ace2 (21115-1-AP, 1:1000, Proteintech，美国)、抗agtr1 (25343-1-AP, 1:5000, Abcam，英国)、抗tmrrss2 (ab92323, 1:1000, Abcam，英国)、抗isg15 (15981-1-AP, 1:5000, Proteintech，美国)、抗phospho- mapk14 (28796-1-AP, 1:1000, Proteintech，美国)、抗phospho- rela (ab76302, 1:1000, Abcam，英国)、抗rela (10745-1-AP, 1:1000, Proteintech，美国)和抗actb (66009-1-Ig, 1:5000, Proteintech，美国)抗体。然后用酶标二抗孵育膜。以β-肌动蛋白为内参。将膜浸入ECL化学发光溶液(k - 12045 - d50, Advantesta, USA)中进行发光可视化。使用化学发光成像系统(ChemiScope 6100, Clinx, China)检测蛋白质条带。这个实验重复了三次。

酶联免疫吸附试验(ELISA)

采用IL-6 (KE00007, Proteintech，美国)、MCP-1 (KE20009, Proteintech，美国)、MDA (#A003-1，南京建成生物工程研究所，中国)、SOD (#A001-3，南京建成生物工程研究所，中国)定量ELISA试剂盒检测相关因子水平。采用DYNATECHM 7000微孔板仪，通过定值形成标准曲线，计算各指标浓度。这个实验重复了三次。

流式细胞术(FCM)

根据ROS检测试剂盒(S0033S, Beyotime, China)评估ROS水平。首先，DCFH-DA(原液浓度10 mM)在无血清培养基中1:1000稀释至终浓度10µM。然后，将上述处理的细胞从细胞培养基中取出，加入DCFH-DA覆盖细胞，在37℃的细胞培养箱中孵育20分钟。胰蛋白酶化收集样本。最后采用FCM (A00-1-1102, Beckman, USA)检测，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。采用CyExpert软件分析ROS水平。这个实验重复了三次。

统计分析

采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析。实验重复了三次。测量数据以平均值±标准差表示。实验重复了三次。三组及以上组的显著性比较采用单因素方差分析。死后检验采用了Tukey的检验方法。P < 0.05为差异有统计学意义。

新型促炎模型的构建

首先建立新冠病毒促炎模型，采用CCK-8法检测细胞活力。与对照组相比，RBD-500组和RBD-1000组在12和24 h时细胞活力下降(图2)。1一)。1bj表示ACE2，AGTR1，TMRRSS2,ISG15RBD-500组和RBD-1000组在12和24 h时ACE2、AGTR1、TMRRSS2、ISG15蛋白表达均升高。其中，1000 ng/mL RBD处理24 h效果更为显著。最后采用ELISA法检测MCP-1、IL-6水平。RBD处理后，MCP-1和IL-6水平均升高，且在1000 ng/mL RBD处理24 h后升高更为明显(图2)。1K -1因此，选择1000 ng/mL RBD处理24 h作为模型组进行后续实验的条件。

GH/E2/Tes在covid -19型促炎模型中的作用

为了研究BEAS-2B细胞GH/雌激素/雄激素对covid -19型促炎反应的影响，我们将细胞与GH、E2和Tes孵育。CCK-8实验显示，RBD处理后细胞活力下降，添加GH和E2后细胞活力恢复。其中E2效果最好，GH次之。而Tes则有相反的效果(图2)。2一)。2B -2J显示ACE2，AGTR1，TMRRSS2,ISG15RBD治疗后，ACE2、AGTR1、TMRRSS2、ISG15蛋白表达均升高。添加GH和E2后，ACE2，AGTR1，TMRRSS2,ISG15ACE2、AGTR1、TMRRSS2、ISG15蛋白表达均降低。其中E2效果最好，GH次之。但是Tes却产生了相反的效果。

GH/E2在covid -19型促炎模型中减轻炎症

接下来，我们检查了与炎症和氧化应激相关的标志物。如图所示。3.A -3.E, RBD治疗后，IL-6、MCP-1、MDA、ROS水平均升高，SOD水平降低。添加GH和E2后，IL-6、MCP-1、MDA、ROS水平均降低，SOD水平升高。其中E2的治疗效果最明显，其次是GH。然而，Tes却产生了相反的效果。

GH/E2可调控MAPK/NF-κB通路

最后，我们检测了MAPK/NF-κB通路相关因子的水平。RBD治疗后，MAPK14和RELA蛋白表达量无明显变化。同时，phospho-MAPK14和phospho-RELA的蛋白表达也增加。添加GH和E2后，MAPK14和RELA蛋白表达量无明显变化。此外，phospho-MAPK14和phospho-RELA的蛋白表达也下降(图2)。4A -4E)。其中E2的作用最明显，其次是GH。但是Tes却产生了相反的效果。

COVID-19是一种以SARS-CoV-2引起的非典型肺炎为特征的新型传染病，可引起人轻至重度感染[19，20.]。目前，新冠肺炎疫情在全球迅速蔓延，给卫生保健机构和医疗基础设施带来了严峻挑战。在本研究中，我们研究了正常人肺上皮BEAS-2B细胞GH/雌激素/雄激素对covid -19型促炎反应的影响。我们发现E2/GH处理后，细胞活力增加，mRNA表达ACE2，AGTR1，TMRRSS2,ISG15ACE2、AGTR1、TMRRSS2、ISG15蛋白表达降低，炎症减轻。E2/GH还能调控MAPK/NF-κB通路。

ACE2是SARS-CoV-2刺突蛋白的受体[9]。SARS-CoV-2通过其表面刺突蛋白与宿主细胞上的ACE2结合[21]，引发复杂的分子事件，导致过度炎症[22]。COVID-19还针对表达其主要受体ACE2的男性和女性生殖器官，尽管尚不清楚这是否对人类生育能力有任何影响[8]。AGTR1是支持血管紧张素信号级联所需的受体，TMPRSS2是一种能够促进病毒融合的蛋白酶[23]。在COVID-19期间，TMPRSS2在呼吸和胃肠道组织中广泛表达[24]。此外，isg15依赖性的MDA5传感器激活被SARS-CoV-2木瓜蛋白酶拮抗以逃避宿主先天免疫[25]。在本研究中，我们发现E2/GH处理后ACE2，AGTR1，TMRRSS2,ISG15ACE2、AGTR1、TMRRSS2、ISG15蛋白表达降低。这表明E2/GH可能对COVID-19具有治疗作用。

生长激素缺乏是所有COVID-19易感患者群体的共同因素[26]。Dhindsa S等在一项针对COVID-19患者的单中心队列研究中发现，住院期间较低的Tes浓度与男性疾病严重程度和炎症升高有关[27]。性激素减轻炎症反应，调节ACE2表达[28]。雄激素受体是TMPRSS2的转录启动子，可促进SARS-CoV-2进入宿主[29]。睾酮可能使男性比雌激素更容易感染COVID-19。血清睾酮水平低，应被认为是严重患者激素环境的一个特征，可能使男性，特别是老年男性预后不良或死亡[30.]。相比之下，E2治疗的血清浓度相当于排卵或妊娠，在小鼠和人类中具有有益的免疫调节和抗炎作用[30.，31]。在本研究中，E2/GH处理BEAS-2B细胞后，IL-6、MCP-1、MDA和ROS水平均降低，SOD升高，提示E2/GH处理可缓解covid -19型促炎反应。

IL-6是COVID-19重症患者释放的促炎因子。该细胞因子激活MAPK/NF-κB-IL-6通路[31]。马强等报道六参胶囊在体外通过下调病毒诱导的炎症细胞因子的表达，调节MAPK/NF-κB信号通路的活性，抑制SARS-CoV-2感染，是很有前景的新型冠状病毒控制候选药物[j]。32]。此外，Sharma VK等报道，纳米姜黄素通过抑制上皮细胞的MAPK/NF-κB通路，有效抑制SARS-CoV-2刺突蛋白诱导的细胞因子风暴[33]。在本研究中，我们发现E2/GH调控MAPK/NF-κB通路。其中E2的作用最明显，其次是GH。但是Tes却产生了相反的效果。

然而，这项研究有一些局限性。我们仅通过体外细胞实验验证GH/雌激素/雄激素在covid -19样促炎模型中的作用。体内动物和人体实验仍然缺乏。由于时间和资金的限制，我们目前无法解决这个问题。未来，我们将进一步探索生长激素/雌激素/雄激素在动物和人类covid -19样促炎模型中的作用。

综上所述，E2/GH处理BEAS-2B细胞后，细胞活力增加，mRNA表达降低ACE2，AGTR1，TMRRSS2,ISG15ACE2、AGTR1、TMRRSS2、ISG15蛋白表达，减轻炎症反应。E2/GH还能调控MAPK/NF-κB通路。我们的研究为新冠肺炎的诊断提供了参考和依据，并为新冠肺炎的治疗提供了新的策略。

本研究中包含的所有数据可通过与第一作者或通讯作者联系获得。

不适用。

株洲市科技局科技规划项目(NO.20215506)和湖南省卫生健康委员会科研项目(NO.202103080027)资助。

作者及单位

1. 株洲中心医院肝胆胰外科，株洲

   朱泽民，赵志坚，陈迅，褚周，唐彩曦

2. 株洲中心医院心血管内科，株洲

   咦,他

3. 株洲中心医院感染性疾病科，株洲

   谭英正，周娟

贡献

朱泽民:概念、方法论、写作——原稿编写

赵志坚:软件，验证;

荀陈;周楚;何毅:数据管理，软件;

即赢政棕褐色;周娟:可视化，调查;

唐彩曦:监督、写作、审稿、编辑。所有作者都阅读并批准了最终稿件。

相应的作者

对应到Caixi唐．

伦理批准和同意

不适用(该研究不包括临床样本或动物实验)。

发表同意书

不适用。

利益冲突

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

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