诱导iPSC-derivedPrg4-阳性细胞，具有浅表区软骨细胞和成纤维细胞样滑膜细胞的特征

背景

润滑剂蛋白是一种蛋白多糖PRG4该基因是由表面区软骨细胞和滑膜细胞合成的。它减少关节之间的摩擦，并允许肌腱平稳滑动。虽然润滑剂已被证明对动物骨关节炎和滑膜炎有效，但其临床应用仍未得到验证。在本研究中，我们旨在从多能干细胞(iPSCs)中诱导表达润滑油的细胞，并通过细胞移植将其局部应用。

方法

生成万能,OCT3/4，SOX2，KLF4,L-MYC被转导成纤维细胞Prg4-mRFP1转基因小鼠。我们为ipsc衍生的鉴别建立了一个协议Prg4-mRFP1-阳性细胞，并对其mRNA表达谱进行表征。最后,我们注入Prg4-mRFP1在严重联合免疫缺陷小鼠的跟腱和膝关节周围，将阳性细胞注入腱旁腺，并评估润滑素的表达。

结果

应用Wnt3a、激活素A、TGF-β1和bFGF诱导ipsc衍生细胞分化Prg4-mRFP1 -阳性细胞。SFZ软骨细胞和成纤维细胞样滑膜细胞(FLSs)相关标记物在分化过程中表达。rna测序表明ipsc衍生Prg4-mRFP1阳性细胞表现为SFZ软骨细胞和FLSs的典型表达谱。移植iPSC-derivedPrg4-mRFP1 -阳性细胞在跟腱和膝关节周围存活。

结论

本研究描述了一种鉴别ipsc衍生的方法Prg4-阳性细胞，具有SFZ软骨细胞和FLSs的特征。表达润滑剂的细胞移植有望成为关节炎和滑膜炎的治疗手段。

润滑剂素是一种高分子量的蛋白多糖PRG4基因。它在关节软骨表面区(SFZ)软骨细胞、滑膜细胞、肌腱细胞和肌腱鞘中表达[1，2，3.，4］．它减少了关节之间的摩擦，使肌腱能够平稳滑动[5，6，7，8，9］．骨关节炎导致软骨细胞破坏增加，关节摩擦和滑膜炎症。当关节软骨在局部表面受损时，软骨细胞被纤维软骨组织所取代。当同样的情况发生在大而深的区域时，软骨细胞不会繁殖，软骨下骨就会暴露出来。腱鞘炎是一种疼痛的情况，它会引起滑膜炎症和肌腱粘连的增加。随后，长时间的腱鞘炎导致肌腱瘢痕，导致其失去平滑滑动。

在早期骨关节炎，只有滑膜炎症，症状可通过关节内注射透明质酸或滑膜切除术缓解。同样，轻度腱鞘炎可通过肌腱鞘内注射类固醇缓解，而对于局部软骨深部缺损，可进行自体软骨移植[10，11］．另一种治疗方法是由间充质干细胞(MSCs)、胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(iPSCs)再生软骨组织[12，13，14，15，16，17，18］．由于其多能性和多功能性，iPSCs已应用于包括软骨和肌腱在内的多种组织和器官的再生医学[19，20.，21，22］．

润滑剂的治疗效果也引起了越来越多的兴趣。关节内注射部分重组人润滑油素(rhPRG4)可防止骨关节炎大鼠模型的软骨退变[6]，全长rhPRG4减轻了小型猪模型内侧半月板失稳后的软骨损伤[23］．除了润滑关节和肌腱外，rhPRG4还通过抑制骨关节炎成纤维细胞分泌的细胞因子(白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α)和细胞因子诱导的滑膜细胞增殖发挥抗炎作用[24，25］．但根据实验结果，可能需要反复注射rhPRG4才能获得治疗效果。此外，基于rhprg4的治疗尚未在临床上应用。在这里，我们假设一种基于注射ipsc衍生的润滑油表达细胞的治疗策略可以提供对骨关节炎和腱鞘炎的有效治疗。在本研究中，我们的目的是用荧光诱导小鼠iPSCs表达润滑油细胞Prg4报告系统，确认移植细胞在体内的植入。

iPSCs的生成和维护

首先，将表达单体红色荧光蛋白(mRFP1)的转基因小鼠置于Prg4通过将转基因注入C57BL/6小鼠受精卵原核产生启动子(Charles River)。耳尖，从Prg4-mRFP1小鼠，用5% CO绞碎胰化15分钟₂在含10%胎牛血清(Thermo Scientific)、50单位/mL青霉素(Wako)和50 μg/mL链霉素(Wako)的标准高糖DMEM中培养至未汇合。为了建立iPSCs，成纤维细胞来源于Prg4-mRFP1转染pMX-hOCT3/4、pMX-hSOX2、pMX-hKLF4和pMX-Hu-L-MYC逆转录病毒载体(Addgene)的转基因小鼠[26］．建立的iPSC克隆在丝裂霉素C (Wako)处理的小鼠胚胎成纤维细胞上维持，ESC培养基由敲除型DMEM (Gibco)、15%胎牛血清、2 mM l -谷氨酰胺(Wako)、1%非必需氨基酸(Wako)组成，并添加1000单位/mL人重组白血病抑制因子(LIF;Wako)， 0.1 mM 2-巯基乙醇(Gibco)， 50 μg/mL l -抗坏血酸(Sigma-Aldrich)， 50单位/mL青霉素，50 μg/mL链霉素。

ESCs的维护

小鼠ESCs (V6.5)在丝裂霉素c处理的小鼠胚胎成纤维细胞ESC培养基(敲除的DMEM含有15%胎牛血清，2 mM l -谷氨酰胺和1%非必需氨基酸)中维持，并添加1000单位/mL LIF, 0.1 mM 2-巯基乙醇，50单位/mL青霉素和50 μg/mL链霉素。

畸胎瘤形成及组织学分析

我们注射了3 × 10⁶iPSCs在200 μl磷酸缓冲盐水中注入严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠皮下组织(n= 4)(查尔斯河)。注射3周后处死小鼠，解剖畸胎瘤，4%多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋。半连续切片用苏木精和伊红染色(H&E)。

诱导iPSC-derivedPrg4阳性细胞

在开始归纳之前Prg4-阳性细胞，iPSCs在含有5% CO的潮湿气氛的iPSC维持培养基中培养4天₂在37℃，直到它们变得不合流。最初，iPSCs在96孔板上分化为胚状体(Nunclon Sphera;在含有10%胎牛血清、青霉素和链霉素的标准高葡萄糖DMEM中注射2天。第2天，培养基更换为含有9 ng/mL激活素A (Peprotech)和25 ng/mL Wnt3a (R&D)的标准培养基进行中胚层分化。第3天，培养基改为含10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF;Wako)，连续培养2 d。第5天，胚状体被分离并作为单分子层重新播种在胶原包被的6孔板上，6孔板含有添加1%胰岛素转移硒(ITS;10 ng/mL转化生长因子β1 (TGF-β1;细胞信号)和10 ng/mL bFGF。每隔一天更换培养基，培养分化细胞至第21天。

荧光辅助细胞分选分析

Prg4-mRFP1在BD FACS Aria流式细胞仪(BD Biosciences)上采用荧光激活细胞分选(FACS)方法筛选阳性细胞。我们使用escs衍生的分化细胞作为阴性对照。使用DIVA软件(BD Biosciences)分析数据，识别ipsc衍生Prg4-mRFP1-阳性细胞的PE-Texas红信号高于阴性对照的esc来源细胞。

定量实时聚合酶链反应

使用RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen)分离总RNA，并根据制造商说明使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)反转录成cDNA。采用TB Green Premix Ex Taq II (TaKaRa)进行实时定量PCR (qRT-PCR)。将靶基因的表达归一化为内参基因的表达(Actb而且Gapdh)，并表示为基于每n 3次技术重复的平均值±标准差，且n= 3个独立实验。用于qRT-PCR的引物见表1．

注入iPSC-derivedPrg4-mRFP1SCID小鼠跟腱和膝关节周围腱旁腺的阳性细胞

我们注入iPSC-derivedPrg4-mRFP1-阳性细胞在1 × 10⁴在SCID小鼠跟腱和膝关节周围的腱旁组织中，细胞/10 μl磷酸缓冲盐水(n(查尔斯河)。注射3天后，处死小鼠，解剖跟腱和膝关节，用4%多聚甲醛固定过夜。

组织学分析

所有组织均在4%多聚甲醛中4℃固定过夜，石蜡包埋。的膝关节组织Prg4-mRFP1转基因小鼠和注射ipsc衍生的SCID小鼠样本Prg4-mRFP1-阳性细胞，4℃，4%多聚甲醛固定过夜，然后EDTA脱钙(G-Chelate Mild;NIPPON Genetics)在4℃下保存2周。半连续切片进行H&E染色。免疫组化切片用大鼠单克隆抗rfp抗体(1:200,5f8;Chromotek)，抗大鼠Histofine简单染色小鼠MAX PO (414,311;Nichirei Bioscience)和DAB底物(K3467;DAKO)。对于免疫荧光，切片用Alexa 594偶联抗rfp抗体(1:2000,150,160;Abcam)。细胞核用DAPI (1:500; Cell Signaling Technology).

RNA-sequencing分析

确定其表达谱，ipsc衍生Prg4-mRFP1-阳性细胞，用FACS(# 2-9)进行分类，在下一代测序仪上进行分析。基于与肌发生、中胚层、巨噬细胞样滑膜细胞(MLSs)、多能性、软骨发生、关节间区、成纤维细胞样滑膜细胞(FLSs)和SFZ细胞相关的标记，生成了与分化过程相关的基因的热图。将获得的图谱与ESC (SRS1026767来自SRA数据库)、中胚层(ERR2179979来自SRA)、软骨细胞(GSE92641来自GEO数据库)、FLSs (GSE142607来自GEO)、MLSs (GSE142607来自GEO)和肌肉(GSE152756来自GEO) rna测序数据集进行比较。

统计分析

使用GraphPad Prism 5软件进行统计分析。采用土耳其后验单因素方差分析进行统计分析。一个P-value < 0.05为差异有统计学意义。基于三个独立实验，数据以平均值±标准差表示。

一代的Prg4-mRFP1转基因小鼠和iPSCs的Prg4-mRFP1记者系统

创建Prg4-mRFP1转基因，我们插入mRFP1表达盒，包含一个Kozak序列和多聚腺苷酸信号，下游3kbPrg4启动子(无花果。1a).将转基因基因注入C57BL/6小鼠受精卵原核中产生Prg4-mRFP1转基因小鼠。为了验证转基因小鼠的成功构建，在跟腱和髌腱周围检测到mRFP1荧光(图。1b);而免疫组化显示mRFP1在关节软骨的肌腱细胞、肌腱滑膜和SFZ软骨细胞中表达(图。1c).这些结果表明Prg4-mRFP1表达系统在体内具有活性，可用于监测润滑油素的生成。接下来，我们生成了含有Prg4-mRFP1记者系统。ipsc样细胞是从成纤维细胞中建立的Prg4-mRFP1逆转录病毒转导转基因小鼠OCT3/4、SOX2 KLF4,而且L-MYC．选择6个ipsc样克隆，qRT-PCR显示iPSCs和ESCs之间多能相关基因的表达相似(图。2a).克隆iPSC(# 2-9)与ESCs最相似(图2-9)。2b)移植到SCID小鼠皮下组织中。移植3周后，可以观察到包括外胚层、中胚层和内胚层组织的畸胎瘤。2c)，确认所建立的iPSCs的多能性。

分化iPSC-derivedPrg4阳性细胞

接下来，我们建立了ipsc衍生的鉴别协议Prg4阳性细胞(图。3.a).首先，iPSCs(#2 - 9)分化为胚状体2天。第2天，加入激活素A和Wnt3a促进原始条纹分化[24，27，28，29]，其次为近轴中胚层和体层[30.，31］．第3天至第5天，在bFGF存在下培养胚状体，以促进巩膜组细胞增殖和分化。第5天，胚状体被分离并重新播种为添加ITS、TGF-β1和bFGF的单分子膜。TGF-β1和bFGF已被证明可促进关节间区SFZ软骨细胞和滑膜细胞的分化[30.，32，33，34，35，36，37］．第21天，在ipsc衍生的分化细胞中检测到mRFP1荧光。的平均值Prg4-mRFP1阳性细胞率为2.2%(最高7.0%)，证实成功生成Prg4-阳性iPSCs细胞(图。3.b和c)。

ipsc衍生的基因表达分析Prg4-mRFP1-阳性细胞qRT-PCR检测

为了研究我们的方案生成的ipsc衍生细胞的分化状态，我们通过qRT-PCR分析了目标mrna的表达随时间的变化。Prg4在SFZ软骨细胞和滑膜细胞中表达[1，2，3.，4］．后者主要分为FLSs和MLSs [38，39］．FLSs来源于间质，分泌润滑素，在正常关节内稳态中发挥关键作用[39，40］．在滑膜关节发育过程中，SFZ软骨细胞和FLSs都从关节间区分化[41，42，43］．因此，我们确认了关节间区(Wnt9a而且Wnt16)[41，42，43), SFZ (Prg4，Erg，过渡委员会,Runx1)[44，45，46，47，48)和FLSs (Cdh11，Col4a，Vcam1，Icam1,Cd248)[49，50，51，52，53，54，55］．的表达Wnt9a而且Wnt16在第12天显著升高，但在第21天下降(图5)。4a).与第21天的mRFP1荧光一致，Prg4在第21天，sfz相关基因的表达显著增加Erg而且过渡委员会(无花果。4a) fls相关基因Cdh11，Col4a,Vcam1(无花果。4a).我们的方案也导致了ESCs的分化，直到第21天，我们通过qRT-PCR验证了这一点。esc衍生的分化细胞表现出与ipsc衍生的相似的基因表达谱Prg4阳性细胞(图。4b).这些结果表明我们的分化方案成功诱导Prg4-阳性细胞来自多能干细胞，并使其具有SFZ软骨细胞和FLS特性。

rna测序分析的facs排序ipsc派生Prg4-mRFP1阳性细胞

论证了成功的归纳Prg4-mRFP1 -通过我们的分化方案，我们继续对阳性细胞进行进一步的表征。流式细胞仪的基础上,Prg4-mRFP1-阳性细胞平均占iPSC(# 2-9)克隆分化细胞的4.9%(最多9.3%)。5a).通过FACS获得的mrfp1阳性细胞的rna测序显示ipsc衍生Prg4-mRFP1-阳性细胞失去了多能干细胞、中胚层和关节区间的特性;然而，它们显示了SFZ软骨细胞和FLSs的特性，而不是深区软骨细胞的特性(图。5b)。

注入iPSC-derivedPrg4-mRFP1-阳性细胞存在于SCID小鼠跟腱和膝关节周围的腱旁腺

最后，我们注入ipsc衍生Prg4-mRFP1在SCID小鼠跟腱和膝关节周围的腱旁组织中，通过FACS获得阳性细胞。免疫组化分析显示，注射3天后，部分ipsc衍生Prg4-mRFP1-阳性细胞仍然存在于跟腱周围和膝关节(图。6)．值得注意的是，在细胞移植后3周，SCID小鼠未观察到畸胎瘤(数据未显示)。这些结果表明移植ipsc衍生Prg4-mRFP1-阳性细胞可以在体内产生至少3天的润滑油素，而没有形成肿瘤的风险。

润滑剂被认为是一种有效的治疗骨关节炎和滑膜炎的药物。然而，重组或合成润滑剂的临床应用还没有尝试过。在本研究中，我们成功地开发了一种从多能干细胞诱导润滑油表达细胞的方法，并证实其分化为Prg4-表达细胞，具有SFZ软骨细胞和关节间区FLSs的特征。

Prg4在SFZ软骨细胞、滑膜细胞、滑膜液、肌腱和肌腱鞘中表达[3.，4］．这种本地化在我们的研究中得到了证实Prg4-mRFP1转基因小鼠。首先，通过将小鼠耳尖成纤维细胞转导为所有四种山中因子[26］．其次，我们为ipsc衍生的鉴别设计了一个协议Prg4-阳性细胞，集中分化为SFZ细胞和FLSs，形成滑膜关节而不是软骨。为了诱导原始条纹，并随后分化为近轴中胚层和躯体，我们遵循了之前关于胚状体在悬浮或粘附中形成4-6天的报道[11，12，15］．为了使分化最大化，我们选择了在悬浮液中形成胚状体5天。基于参与该过程的已知细胞因子[12，14，15]，我们选择Wnt3a、激活素A和bFGF来促进滑膜关节前体巩膜组的分化。虽然骨形态发生蛋白(BMP) 4对原始条纹的诱导有用，但它不能导致近轴中胚层的分化，因此在这种情况下没有应用。

对于软骨分化，大多数研究采用无血清培养基[13，14，15]或1%胎牛血清[12]，以及ITS、bFGF、BMP2、TGF-β1、TGF-β3、生长分化因子5、TD-198946和抗坏血酸等细胞因子。我们在含有10%胎牛血清、ITS、bFGF和TGF-β1的培养基中培养iPSCs进行分化Prg4-阳性的SFZ细胞和滑膜关节FLSs。

为了确认成功分化，我们使用qRT-PCR分析了ipsc衍生分化细胞随时间的mRNA表达。Wnt9a而且Wnt16在关节区间非常重要，对滑膜关节的发育很重要[41，42，43］．Wnt16也支持SFZ祖细胞的表型和润滑油素的表达[56］．在分化,Wnt9a而且Wnt16在第12天出现明显的上升，然后在第21天下降。这种表达动态表明，iPSCs在第12天在关节区间分化，随后进入下一个分化阶段。

除了Prg4， SFZ软骨细胞中表达的其他基因包括Erg、过渡委员会,Runx1［44，45，46，47，48］．我们证实表达增加Prg4，Erg,过渡委员会在第21天，但在第12天几乎没有发现他们。Cdh11，Col4a，Cd55，Vcam1，Icam1,Cd248在滑膜关节的FLSs中表达[49，50，51，52，53，54，55］．这里是SFZ软骨细胞标记Prg4，Erg,过渡委员会表现出与FLS标记相似的表达模式Cdh11，Col4a,Vcam1．这些结果表明iPSCs分化为Prg4-表达细胞通过关节间区。对esc衍生的分化细胞中mRNA表达的分析产生了与iPSCs中相似的时间模式，这表明我们的方案适用于所有多能干细胞。rna测序证实ipsc衍生Prg4-阳性细胞(克隆# 2-9)与深区软骨细胞、中胚层细胞、肌原细胞和MLSs相比，更类似于SFZ软骨细胞和FLSs，表明ipsc衍生Prg4-阳性细胞在滑膜关节中具有SFZ软骨细胞和FLSs的特征。事实上，SFZ软骨细胞和FLSs是代表性的润滑油表达细胞，表达量高于深层软骨细胞、中胚层细胞、肌原细胞和MLSs。因此，本研究结果在诱导具有SFZ软骨细胞和FLS特征的高表达润滑油细胞方面具有重要意义。

最近的再生治疗策略更倾向于使用干细胞而不是自体软骨移植来补充缺失或受损的软骨[10，11］．这种方法的例子包括使用人类ESCs生成关节软骨[15]，从人类iPSCs中生成无支架透明软骨[12),代Col2a1-EGFPiPSCs用于监测软骨分化[13]，利用人类间充质干细胞形成稳定的人类关节软骨[16，17]，使用取自猪滑膜间充质干细胞的无支架结构进行软骨修复[18]，以及小鼠ESCs的软骨细胞和软骨组织的规格[14］．本研究旨在通过移植为关节炎关节和腱鞘炎提供润滑Prg4而不是再生受损的软骨组织。因此，我们注入ipsc衍生Prg4-mRFP1 -阳性细胞进入SCID小鼠跟腱和膝关节周围的腱旁腺，证实细胞在体内存活和润滑油素表达。最近的一项研究表明Prg4-谱系细胞在关节SFZ分化为关节软骨细胞[57]，表明ipsc衍生的注射Prg4-表达细胞也可能有再生关节软骨的潜力。我们的方法的主要优势是可以通过iPSCs获得大量表达prg4的细胞，这种细胞具有较高的自我更新能力。关于细胞来源，我们可以使用间充质干细胞Prg4-mRFP1报告系统，制定MSC的差异化方案Prg4阳性细胞。间充质干细胞的分化效率Prg4-阳性细胞可能变得更好，因为使用MSCs可以跳过iPSC向间充质谱系分化的过程。成熟的Prg4-表达的细胞也可以获得，然而，可能很难获得和扩大大量的Prg4-表达细胞在临床应用中，特别是在老年患者中。

最后，在临床应用前需要克服几个障碍Prg4表达的细胞。首先，该方法的缺点是诱导效率不足Prg4-mRFP1阳性细胞，平均4.9%(最高9.3%)。同样，用同样的方法，我们之前诱导了腱细胞样细胞Scx-EGFP万能(58］．肌腱细胞与软骨细胞和滑膜细胞具有相同的从体到巩膜的发育过程。考虑到Prg4-表达已在ipsc衍生的肌腱中得到证实Prg4本研究中的-阳性细胞可能含有肌腱细胞。因此，应优化分化方案，以提高诱导效率和纯度Prg4-表达SFZ和FLS特征的细胞。第二，我们需要延长注射后这些细胞的存活时间。移植Prg4-mRFP1-阳性细胞在跟腱和膝关节周围的腱旁腺被检测到，但只持续了3天。使用支架材料或富含血小板的血浆可能提供一种物理方法来改善ipsc衍生的暂时生存Prg4表达的细胞(59，60］．此外，含有细胞因子、生长因子和外泌体的条件培养基已用于再生医学，许多研究显示了它们的疗效[12］．事实上，我们之前关于表达Scx-EGFP的ipsc衍生的肌腱细胞移植的研究显示，细胞移植具有双重作用，直接促进再生肌腱，并具有减少疤痕形成的间接作用(旁分泌效应)[58］．值得注意的是，旁分泌效应被认为对再生的贡献更大，这表明细胞因子、生长因子和从诱导细胞释放的外泌体在再生中有重要作用。因此，介质的条件Prg4-mRFP1表达细胞可能成为抗骨关节炎和滑膜炎的替代再生剂，也可能延长骨关节炎和滑膜炎的生存期Prg4-mRFP1移植后阳性细胞。此外,移植Prg4与rhPRG4给药治疗相比，在这种旁分泌效应方面，表达细胞可能是有益的，而不是润滑素。第三，确定ipsc衍生的定植Prg4为了避免免疫排斥反应，我们用SCID小鼠进行移植实验。然而，骨关节炎或滑膜炎模型的移植可能需要证实ipsc衍生的治疗效果Prg4表达的细胞。我们需要进一步的实验来揭示它的治疗效果。

本研究描述了携带a的小鼠iPSCs的生成Prg4-mRFP1报告系统和多能干细胞分化方案的建立Prg4-表达细胞，表现出SFZ软骨细胞和FLSs的特征。在关节和肌腱周围的腱旁腺注射产生润滑剂的细胞可能成为骨关节炎和腱鞘炎的一种可行的治疗方法。

ipsc衍生的RNA-seq数据Prg4-mRFP1-阳性细胞可在SRA数据库(PRJNA839189)中找到。

bFGF:

基本成纤维细胞生长因子

骨形态发生蛋白:

骨形成蛋白

ESC:

胚胎干细胞

读者:

呈滑膜细胞

iPSC:

诱导多能干细胞

其:

Insulin-transferring-selenium

生活:

白血病抑制因子

美国职业足球大联盟:

Macrophage-like滑膜细胞

硕士:

间充质干细胞

存在:

定量实时聚合酶链反应

rhPRG4:

重组体人lubricin

招标书:

红色荧光蛋白

SFZ:

肤浅的区

TGF -β:

转化生长因子β

我们非常感谢钱存训教授提供mRFP1构造(61］．

作者声明他们没有任何经济利益，也没有收到与本研究相关的资金。

作者和联系

1. 日本岐阜大学医学院整形外科

   佐竹隆，高村慎吾，平川昭弘和秋山晴彦

2. 日本岐阜大学医学研究生院，高等医学，组织与器官发育系

   这什么青木

3. 日本，松山，爱媛大学医学院，蛋白质科学中心，综合病理生理学研究室

   较Imai

贡献

t.s.， s.k.和A.H.进行了实验。S.K.和H.A.提出了研究方案并设计了实验。t.s.， s.k.和H.A.撰写了手稿。H.A.和Y.I.进行了rna测序实验，并提供了技术建议。作者(们)阅读并批准了最终稿。

相应的作者

对应到取高．

伦理批准和同意参与

所有动物实验均经歧阜大学动物实验伦理委员会批准(批准号27-38)，符合arrival指南。实验动物的所有程序均按照歧阜大学校规指导方针进行。在这项研究中没有使用人类受试者。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

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