高microrna的- 378表达对肺结核有很高的诊断价值，可预测不良预后

背景

肺结核(TB)是一种慢性传染病。microRNA (miR)-378参与结核病诊断。这项研究探讨了mir - 378对结核病患者的影响。

方法

共选取126例结核患者，其中活动性结核63例，潜伏性结核63例，健康对照组62例。血清mir - 378检测表达。诊断价值mir - 378采用ROC曲线进行分析。检测免疫炎症因子水平及其与mir - 378进行表达分析。在标准治疗后记录活动性肺结核患者的耐药情况。mir - 378在耐药结核病患者中检测到基因表达。的影响mir - 378对不良结局发生率进行分析。

结果

mir - 378在结核中呈高表达，且活性组高于潜伏组。血清miR-378表达> 1.490在结核病诊断中具有较高的敏感性和特异性。mir - 378表达与结核临床指标相关。结核患者IL-4、IL-6、IL-1β水平高表达，IFN-γ、TNF-α、IL-12水平低表达。血清mir - 378与血清IL-4、IL-6、IL-1β呈正相关，与血清IFN-γ、TNF-α、IL-12呈负相关。mir - 378在单药耐药组(SDR TB)和多药耐药组(MDR TB)中表达下调mir - 378SDR TB组和MDR TB组的表达高于TB治疗组，SDR TB组低于MDR TB组。高mir - 378表达预测较高的不良结局发生率。

结论

高mir - 378表达有助于结核病诊断和预测不良结果。

肺结核(TB)是一种慢性传染性疾病，几乎完全通过咳嗽气雾剂传播，由结核分枝杆菌复合体引起，其特征是肺内坏死性肉芽肿性炎症，尽管几乎任何肺外部位都可能受到影响[1］．目前，耐药形式的结核病正趋向于成为全世界最致命的病原体，造成四分之一的耐药死亡[2］．包括家庭的社会经济地位、窗户较少的住房和室内空气污染在内的风险因素是结核病感染和疾病的有力预测因素，曾经患过结核病的人再次患结核病的风险更高，进一步加剧了结核病和贫困的恶性循环[3.］．结核病的临床诊断程序耗时且不充分，往往导致延误诊断或误诊，从而增加发病率和死亡率或过度治疗的风险[4］．由于结核分枝杆菌菌株的进化，其感染阶段从潜伏期到耐药期不等，因此该病较为复杂。一般有三分之一的患者表现为潜伏感染，因为结核分枝杆菌长期处于潜伏状态，在免疫功能低下的情况下容易发生活动性疾病[5］．这种潜伏的疾病对人类是个威胁。因此，识别具有诊断潜力的结核分枝杆菌抗原的策略是识别感染期间或特定疾病阶段特异性诱导的基因。目前免疫诊断的缺点包括无法发现从潜伏感染到活动性结核病的进展，以及无法监测治疗效果[6］．此外，世界卫生组织(世卫组织)在其高度优先目标产品[7]，这突出了对新的结核病生物标志物的需求。这些生物标志物在结核病感染的诊断中应该具有高度的敏感性和特异性，并且可以清楚地区分潜伏性和活动性结核病。

已报道了几种用于结核病诊断的血清学蛋白[8，9］．但稳定性差，操作复杂，限制了蛋白质检测的重复性[10，这进一步限制了它们的临床应用。microRNAs (miRNAs)是一类长度为21-23 nt的小的非编码rna，在翻译后水平调控基因表达，与靶基因3 ' untranslation region (3 ' utr)的位点结合，导致翻译抑制或转录产物的降解，在细胞分化、增殖、死亡和凋亡等生物过程中发挥多种功能，特别是在结核病感染中发挥重要作用[11］．血清mirna更容易和更稳定地检测，因此，血清mirna是许多疾病潜在的良好生物标志物[12］．最近的研究已将miRNAs确定为结核病的候选生物标志物[5，13，14］．包括miR-378在内的多种血清miRNAs在结核病患者与健康人群中表现出显著差异[10］．miR-378初步被确定为TB患者血清中的特异性miRNAs之一[10]，但miR-378与潜伏性结核感染(LTBI)和活动性结核病之间的关系尚未见报道。

结核病的发生会导致免疫系统的改变[15］．结核病感染的免疫反应主要依赖于CD4 + T细胞[16］．CD4 + T淋巴细胞可分化为Th1、Th2、Th17、调节性T细胞(Treg)等多种效应细胞。Th1/Th2和Th2之间的失衡在TB发展的外周免疫反应中具有重要意义[17］．Th1细胞主要产生IFN-γ、TNF-α和IL-12控制结核分枝杆菌等胞内感染，Th2细胞产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-13和IL-1β介导液体免疫[18］．在结核分枝杆菌感染患者中，免疫反应通常分化为Th2细胞作为一种逃避形式[19］．IFN-γ/IL-4可作为LTBI和结核病主动筛查的有效血清生物标志物组合[20.］．miR-378已被报道参与调节肿瘤、肌肉萎缩、动脉粥样硬化和其他疾病的免疫过程[21，22，23］．在结核分枝杆菌感染过程中，miR-378d对降低结核分枝杆菌细胞内存活起作用[24］．因此，我们推测miR-378的表达与免疫系统有关，可以在结核病的诊断中发挥辅助作用。本研究旨在探讨血清miR-378与结核病患者临床病例参数的关系及其诊断价值。

道德声明

实验由陕西省结核病预防控制研究所学术伦理委员会授权(2020,072,212)。所有程序都严格按照道德规范执行。所有受试者在取样前均被充分告知研究目的并签署知情同意书。

研究对象

本研究前瞻性纳入2018年6月至2020年5月陕西省结核病预防控制所住院的126例结核病患者(研究组)。将患者按病情分为2个亚组，其中活动性肺结核(活动性组)63例，体检发现潜伏性肺结核感染(潜伏组)63例。另外，选取同期在陕西省结核病防治所接受体检的62人(对照组)。采集所有受试者的全血样本(4℃、1500 × g离心10分钟，-70℃保存)。按照国家卫计委发布的《2018年肺结核诊断标准》实施。

纳入和排除标准

活动性结核病的诊断标准为:典型临床症状、胸片及ct影像、结核分枝杆菌痰培养阳性。

潜伏性结核病的诊断标准如下:按照制造商的指南，所有参与者都采用QuantiFERON-TB (QFT) Gold试验(Qiagen, France)进行筛查。结果阳性、胸片结果正常、无临床症状的参与者被认为是潜伏性结核。

同期健康受试者的标准为:QuantiFERON-TB检测阴性，无免疫疾病，检查后排除结核感染，临床一般资料齐全。

排除标准为:退出实验、再治疗结核病、合并恶性肿瘤、过去半年有免疫制剂史、分组前有抗结核治疗史、失访者。

耐药结核组纳入标准

在63例活动性结核病患者中，17例未开始抗结核治疗(TB naïve组)，其余46例患者采用标准治疗方案，包括利福平和异烟肼。治疗后临床症状无明显改善的患者在16周结束时抗酸杆菌(AFB)阳性，并检测利福平和异烟肼突变，并被分类为单药耐药(SDR)和多药耐药(MDR)结核病。具体分组如下:不完全抗结核治疗组(结核病初治组、N= 17)，单耐药组(SDR TB组，N= 12)，耐多药组(MDR TB组，N= 15)，无耐药组(tb治疗组，N= 19)。

数据收集及跟进

记录所有入组受试者入组时的资料，包括结核病患者和正常人的性别、年龄、体重、吸烟、饮酒、结核分类，活跃组和潜伏组咳痰、胸痛、低热、咯血情况。随访结核患者6个月，记录不良结果。不良结局定义为死亡、不良反应、随访失败和转向耐药性。死亡是指在治疗过程中因任何原因死亡的患者。不良反应是指患者在治疗过程中因药物引起的有害或不良反应。随访失败是指患者连续中断治疗2个月或以上。转向耐药是指患者在接受一段时间治疗后对一种或多种抗结核药物产生耐药[25，26］．

酶联免疫吸附试验(ELISA)

然后检测免疫和炎症因子。严格按照ELISA试剂盒指示检测miR-378高表达组和低表达组血清中IFN-γ、IL-4 (I-bio，福州，江西，中国，IB-E10033, IB-E10051)、TNF-α、IL-6、IL-12 (RAB0478, RAB0306, RAB0252, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)和IL-1β (ab9722, Abcam, Cambridge, UK)水平。样品与包被液在ELISA板中37°C孵育2小时，然后在4°C用10%的小牛血清密封过夜。洗净样品，37℃一抗孵育2 h, 37℃二抗孵育1 h。显影后加入终止液，在450 nm处测量各孔的光密度(OD)值。

总RNA提取及逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)

总RNA采用TRIzol试剂(ZCIBIO科技有限公司，上海，中国，ZC-0021A)提取。使用PrimeScript RT试剂盒(Shrbio，南京，江苏，中国，DRR037A)将总RNA转录为cDNA。qPCR在ABI7900HT快速实时PCR系统(Yihbio，中国上海)上进行，使用SYBR®Premix Ex Taq™II (Shanranbio，中国上海)。反应条件为:95°C预变性10 min, 95°C变性10 s, 60°C退火20 s, 72°C延长34 s。以U6为内参，数据分析采用2^−ΔΔCt方法。引物由上海生工生物技术有限公司合成，序列见表1［27］．

数据分析

采用SPSS 21.0统计软件(IBM Corp. Armonk, NY, USA)和GraphPad Prism 6.0软件(GraphPad software Inc, San Diego, CA, USA)进行数据统计分析和制图。采用Shapiro-Wilk检验检验数据的正态分布。计数数据以例数/百分比(n/%)表示，采用卡方检验进行比较。计量资料以均数±均数标准误差(SEM)表示，两组间资料采用独立比较t组间数据比较采用单因素方差分析(One-way analysis of variance, ANOVA)，然后采用Tukey多元比较检验。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析miR-378在TB鉴别中的价值，采用卡方检验和Kaplan-Meier法分析miR-378表达对不良结局发生率的影响。采用Log秩法检验Kaplan-Meier曲线组间的差异。P< 0.05为差异有统计学意义。

受试者的临床基线特征

选取126例结核患者(其中活动性结核63例，潜伏性结核63例)，并选取同期在陕西省结核病防治所接受健康检查的62例作为对照。三组患者在性别、年龄、体重、饮酒史等临床基线数据上无显著性差异(P> 0.05)，活跃组与对照组在结核分枝杆菌阳性感染、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)等方面差异均有统计学意义，活跃组与潜伏组在吸烟史、咳痰、胸痛、低热、咯血、结核分枝杆菌阳性感染等临床指标与对照组差异均有统计学意义P< 0.05，表2)．

mir - 378在结核病患者血清中高表达，具有较高的诊断价值

的表达式mir - 378比较活跃组和潜伏组正常人和结核患者血清中抗结核药物的含量。与对照组相比，mir - 378活性组和潜伏组均上调，且mir - 378活性组表达量高于潜伏组(P< 0.05，图;1A).此外，的ROC曲线mir - 378用于结核病诊断(图;1罪犯)。曲线下面积(AUC)mir - 378区分正常组与活动组的分界值为0.849，分界值为1.490(敏感性为77.420%，特异性为79.370%)。1B);AUC的mir - 378区分正常组与潜伏组的分界值为0.898，截断值为1.275(敏感性为80.660%，特异性为82.540%)。1C).的AUCmir - 378区分活性组与潜伏组的分界值为0.767，截断值为2.130(敏感性为92.060%，特异性为52.380%)。1D).这些结果表明，血清表达mir - 378< 1.490有助于结核病的诊断。

的相关性mir - 378结核病患者的临床基线特征

的相关性mir - 378进一步研究结核病患者的临床基线特征。的表达式mir - 378与结核病患者的性别、年龄、体重、饮酒史无显著相关性(均P> 0.05)，与吸烟史、咳痰、胸痛、低热、咯血均有显著相关性(p < 0.05)P< 0.05，表3.)．

miR-378的表达与结核病患者的活动独立相关

结核病是一种慢性传染病，与患者自身免疫功能有关。近年来，由于炎症因子、免疫功能等相关指标在结核病患者中的特异性表达，已成为临床研究的热点[28］．miR-378作为一种转录后调节因子，一直在调节免疫细胞中发挥重要作用[29］．观察对照组、活性组和潜伏组免疫炎症因子IFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-6、IL-12、IL-1β水平。与对照组相比，活性组和潜伏组IFN-γ、TNF-α、IL-12水平降低，IL-4、IL-6、IL-1β水平升高;与潜伏组相比，活性组IFN-γ、TNF-α、IL-12水平降低，IL-4、IL-6、IL-1β水平升高P< 0.05，图;2A).为了研究miR-378与结核患者IFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-6、IL-12、IL-1β的关系，采用Pearson法进行检测。活性组和潜伏组血清miR-378水平与血清IFN-γ、TNF-α、IL-12浓度呈负相关，与IL-4、IL-6、IL-1β浓度呈正相关(图)。2c)。

进一步研究miR-378表达与结核患者临床病理特征的独立相关性。首先，采用logistic单变量回归分析检测结核病患者的临床指标和活动度。然后以活动性TB为因变量，根据单因素回归分析结果，痰咳、胸痛、低热、咯血、COPD、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-12、高血压、miR-378等临床指标与患者的相关性P< 0.1作为自变量纳入多因素logistic回归分析。在调节咳痰、胸痛、低热、COPD、IFN-γ、高血压、咯血、IL-4、IL-6和IL-12后，miR-378与结核病患者的活动独立相关(P= 0.047, = 39.016, 95% CI: 1.054—-1444.199)(表3.)．

mir - 378在耐多药结核病患者的血清中高表达

积极组46例患者已接受抗结核治疗(≥6个月)，其中无耐药19例(治疗组)，多药耐药或单药耐药27例。27例患者均被证实为单药耐药(SDR结核组、N= 12)或MDR TB (MDR TB组，N= 15)。确定之间的关联mir - 378以及耐药结核病患者mir - 378比较结核初治组、结核治疗组、SDR结核组和MDR结核组血清中的表达。与TB naive组相比mir - 378在TB治疗组、SDR TB组和MDR TB组均下调。与治疗组相比，治疗组的治疗效果显著mir - 378与MDR TB组相比，SDR TB组和MDR TB组的mir - 378SDR TB组表达下调(P< 0.05，图;3.)．以上结果表明mir - 378在耐药结核病中高度表达

高表达mir - 378预测结核病患者预后不良

在本研究中，阳性组的结核患者被分为低表达组(N= 31)和高表达组(N= 32)，以miR-378中位表达为界，预测积极组治疗后6个月内不良预后的发生率。两组间预后有差异(P< 0.05)。低表达组不良结局发生率为6例(19.355%)，低于高表达组17例(53.125%)。Kaplan-Meier分析表明，曲线的mir - 378高表达组左移(P< 0.01，图;4)，表明高表达组不良结果的累积发生率较高。这些结果提示mir - 378表达与不良预后相关。

结核病是世界各地成年人因传染病死亡的主要原因，几十年来一直被确定为全球公共卫生的紧急情况[3.］．有证据表明……的重要作用mir - 378在结核病中[10］．本研究表明，高表达mir - 378可以帮助诊断结核病并预测不良结果。

多种miRNAs已被确定为结核病潜在的早期生物标志物[11，30.］．但其表达及诊断价值mir - 378仍然不清楚。我们的研究结果表明，与正常受试者相比mir - 378在活动性结核病患者和潜伏性结核病患者血清中均上调，且mir - 378活性组的表达量高于潜伏组。一致地,mir - 378在结核病患者中表达上调[31］．进一步研究的表达mir - 378在结核病的临床诊断中，我们绘制了ROC曲线。我们的研究结果表明mir - 378区分正常组和活跃组的灵敏度为0.849，临界值为1.490，敏感性77.420%，特异性79.370%;的AUCmir - 378区分正常组与潜伏组的临界值为0.898，临界值为1.275，敏感性为80.660%，特异性为82.540%;的AUCmir - 378区分活性组和潜伏组的临界值为0.767，临界值为2.130，敏感性为92.060%，特异性为52.380%。最近的一项研究表明mir - 378可以作为一种很有前途的结核病生物标志物[10］．简而言之，血清mir - 378< 1.490有助于结核病的诊断，准确区分潜伏性结核病和活动性结核病。进一步，我们研究了之间的相关性mir - 378结核病患者的表达和临床病理特征。吸烟和饮酒是患结核病的危险因素[32］．肺结核的症状为咳嗽(100%)、胸痛(80%)、咳痰(100%)、咯血(33.3%)、发热(93.33%)、厌食(86.66%)及体重减轻(80%)[33］．我们的研究结果表明mir - 378表达与吸烟史、咳痰、胸痛、低热、咯血有显著相关性。

结核病患者炎症因子和免疫功能有特异性表达[28］．间接证据支持结核分枝杆菌在主导Th1环境中诱导一个小但重要的Th2颠覆性反应，导致细菌增殖和疾病进展的可能性[34］．IFN-γ是一种免疫因子，IL-4是一种炎症因子[35，36］．促炎细胞因子是T细胞、巨噬细胞和其他免疫细胞产生的信号分子，可以促进炎症和免疫。主要基于动物模型研究，认为IFN-γ、IL-4、TNF-a、IL-6、IL-12、IL-1β等细胞因子在宿主对TB的抗性中起主要作用[37］．活动性肺结核患者IFN-γ水平降低，IL-4水平升高;IFN-γ在活动性结核病向潜伏性结核病转变的过程中呈增加趋势，而IL-4在这一过程中呈减少趋势[18］．我们的结果显示，与正常受试者相比，活动性肺结核患者和潜伏性肺结核患者IFN-γ、TNF-α和IL-12水平降低，IL-4、IL-6和IL-1β水平升高;与潜伏性肺结核患者相比，活动性肺结核患者IFN-γ、TNF-α和IL-12水平降低，IL-4、IL-6和IL-1β水平升高。一致地,mir - 378作为转录后调节因子在免疫发病机制中发挥重要作用[29］．来研究之间的关系mir - 378以及IFN-γ和IL-4水平，我们进行了Person分析。我们的结果显示，活性组和潜伏组的血清miR-378水平与血清IFN-γ、TNF-α和IL-12浓度呈负相关，与IL-4、IL-6和IL-1β浓度呈正相关。总之，我们的结果揭示了血清miR-378表达与结核病患者免疫功能之间的关系。

全世界结核病的管理和控制面临着耐药情况不断恶化的挑战[38］．确定之间的关系mir - 378和耐药结核病患者，我们比较了血清mir - 378药物治疗后的表达。我们的结果显示，与初治结核病的患者相比，mir - 378在结核治疗患者、SDR结核患者和MDR结核患者中表达减少。与结核病患者相比，mir - 378SDR结核患者和MDR结核患者中表达升高;与耐多药结核病患者相比mir - 378在SDR结核病患者中表达降低。但是，目前还没有关于表达的报道mir - 378在耐药结核病中。这项研究发现mir - 378首次在耐药结核病中高表达。

此外，多种miRNAs与结核病的不良结果密切相关[39］．我们分析了高表达和低表达的结核患者不良结局的发生率mir - 378．我们的结果发现，不良结局发生率低的患者mir - 378表达6例(19.355%)，低于高mir - 378表达(17例)(53.125%)。曲线mir - 378高表达组左移，提示高表达患者不良结局累积发生率较高mir - 378表达式。简而言之，提升mir - 378表达与不良预后相关。mirna介导的结核病调控研究非常广泛。作为反应的调节因子和调控因子，可能通过表观遗传机制(组蛋白乙酰化或DNA甲基化)及其靶向通路的影响来调控疾病的进展，有待进一步探索。

综上所述，作为前瞻性研究，表达mir - 378首次测定了结核病患者血清中的作用mir - 378采用ROC曲线研究其在结核病诊断中的表达。的影响mir - 378通过生存分析和logistic回归分析确定其在结核病不良结局中的表达，为临床病情判断和不良结局预测提供了新的出发点。但本研究纳入的病例和事件数量较少，有必要进一步扩大样本量，开展多中心研究。的机理mir - 378在结核病细胞中没有被讨论。此外，由于实验周期和资金的限制，我们没有检测到Th1/Th2免疫细胞平衡的变化。这些不足需要在今后的研究中加以补充，以进一步明确其诊断和预后评价能力mir - 378．进一步的工作是为了测定血清的表达mir - 378以研究其对细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。

在这项研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章中。

不适用。

本研究得到陕西省卫计委规划研究基金项目的支持;项目名称:陕西省耐多药结核病患者三维综合管理模式研究(2016D097)。资助机构没有参与研究的设计、数据的收集、分析和解释，也没有参与手稿的撰写。

作者及隶属关系

1. 陕西省结核预防控制所结核病防治科，陕西西安市兴庆南路4号，710048

   孙晓璐，赵燕，张天华

2. 西安交通大学第一附属医院骨科，中国西安

   刘凯

贡献

XLS和THZ是整个研究完整性的保证;XLS和THZ参与了研究设计和临床研究;XLS对研究概念、知识内容定义和数据分析做出了贡献;XLS和YZ参与文献研究和数据采集;XLS、THZ和YZ对实验研究有贡献;XLS和KL参与了统计分析、手稿准备、手稿编辑和手稿审查。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到小路的太阳．

伦理批准并同意参与

实验由陕西省结核病防治研究所学术伦理委员会授权。所有程序都严格按照道德规范执行。所有受试者在取样前均被充分告知研究目的并签署知情同意书。我们确认所有的方法都是按照相关的指导方针和规定执行的。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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