青咖啡豆提取物对小鼠脂肪积累和体重增加的抑制作用

背景

在意大利进行的一项流行病学研究表明，咖啡是常见饮料中抗氧化能力最强的。青咖啡豆富含绿原酸及其相关化合物。研究绿咖啡豆提取物(GCBE)对小鼠脂肪积累和体重的影响，探讨其对轻度肥胖的影响。

方法

雄性ddy小鼠饲喂含有GCBE及其主要成分，即咖啡因和绿原酸的标准饮食14天。此外，在连续给药(13天)GCBE及其成分后，研究肝脏甘油三酯(TG)水平。为了检验GCBE及其成分对脂肪吸收的影响，我们在橄榄油负载的小鼠中评估了血清TG的变化。此外，为了研究对肝脏TG代谢的影响，在连续摄入GCBE(6天)及其成分(咖啡因、绿原酸、新绿原酸和阿魏酰奎宁酸混合物)后，评估小鼠肉碱棕榈酰转移酶(CPT)活性。

结果

结果发现，0.5%和1% GCBE可降低内脏脂肪含量和体重。咖啡因和绿原酸有降低内脏脂肪和体重的趋势。口服GCBE(100和200 mg/kg·天)13天显示出降低小鼠肝脏TG的趋势。在相同模型下，绿原酸(60 mg/kg·day)可降低肝脏TG水平。在橄榄油(5 mL/kg)、GCBE(200和400 mg/kg)和咖啡因(20和40 mg/kg)的小鼠中，血清TG水平降低。GCBE(1%)、新绿原酸(0.028%和0.055%)和阿魏酰奎宁酸(0.081%)合剂显著增强小鼠肝脏CPT活性。然而，单独使用咖啡因和绿原酸都不能提高CPT活性。

结论

这些结果表明，GCBE可能通过抑制脂肪吸收和激活肝脏脂肪代谢来有效抑制体重增加和脂肪积累。发现咖啡因是一种脂肪吸收的抑制因子，而绿原酸则部分参与了GCBE的抑制作用，导致肝脏TG水平的降低。除绿原酸外，新绿原酸和阿魏酰奎宁酸混合物等酚类化合物可增强肝脏CPT活性。

咖啡是世界上最常见的饮料之一。然而，由于咖啡因对心血管系统的副作用，它对中枢神经系统的刺激作用显著降低了摄入咖啡因的频率[1，中枢神经系统[2]，以及内分泌系统[3.］．另一方面，科学研究表明，咖啡和咖啡因对现代社会的各种退行性疾病都有预防作用。范·达姆和费斯肯斯[4的研究报告称，每天适量饮用咖啡有助于降低患2型糖尿病的风险，而Fredholm和Lindgren发现咖啡因促进大鼠脂肪细胞的脂肪分解[5］．人体研究表明咖啡因能提高能量消耗6]，改善糖尿病患者的临床状况[7，8］．格里尔的另一项研究et al。发现摄入咖啡因会促进葡萄糖的消耗，使血液中的肾上腺素增加[9]，而运动前的消耗则促进通风和促进脂肪分解[10］．绿原酸是咖啡豆的另一主要成分，最近有报道称其可选择性抑制肝脏葡萄糖-6-磷酸酶[11]，这是一种参与糖异生的速率限制酶。然而，烘焙咖啡豆已被证明可以降低咖啡中绿原酸的含量[12］．青咖啡豆富含绿原酸及其相关化合物，具有降血压的作用[13］．本研究研究了绿咖啡豆提取物及其主要成分对小鼠体重和内脏脂肪含量的影响。此外，还研究了GCBE对脂肪吸收和代谢的影响。

动物

实验使用雄性ddy小鼠(Japan SLC Inc.， Shizuoka, Japan)。动物被安置在23°C±1°C的环境中，喂养标准的非纯化饲粮(CE-2, Clea Japan Inc.，静冈县，日本)和自来水随意．实验是按照《动物实验指南》(日本实验动物科学协会，1987)进行的。所有的实验设计都得到了实验动物使用伦理委员会的批准。

GCBE的制备与测定

GCBE(得率:13.7%)是从生咖啡(coffea canephora)大豆在70°C使用70%乙醇2小时。以无水咖啡因(Kishida Chemical Co.， Japan Osaka)和绿原酸(Sigma-Aldrich Co.， Ltd.， St. Louis, MO, USA)为标准，采用高效液相色谱法(HPLC)对咖啡因、绿原酸及其相关化合物进行分析(图1)1)．使用了配备有Capcellpack C18 (4.6 φ × 250 mm，资生堂，东京，日本)和光电二极管阵列检测器(SPD-10 Avp，岛津岛，日本京都)的HPLC。所用溶剂包括(A) 2mm H_3.阿宝₄和(B) CH_3.CN;35 min后，由(a)的线性梯度变为(B)。流速维持在1.0 mL/min。咖啡因和绿原酸的检出量分别为10.0%和27.0%。如图所示2， GCBE含有绿原酸和其他相关化合物，即3-咖啡酰奎尼酸(新绿原酸)和阿魏酰奎尼酸的混合物。这些化合物是从GCBE中分离和鉴定的[14］．3-咖啡酰奎宁酸和标准绿原酸阿魏酰奎宁酸混合物的用量分别为5.5%和16.0%。从日本butterbur中分离得到的样品中4,5-二咖啡基奎宁酸的含量为5.2%。

试剂

使用Sesamin (Industrial Research, Ltd, Wellington, New Zealand)和奥利司他(Hoffman-La Roche Ltd, Basel, swiss)作为参考化合物。EDTA购自Kishida Chemical Co.， Ltd (Osaka, Japan)，棕榈酰辅酶a和左肉碱购自Sigma-Aldrich Co.， Ltd (MA, USA)。无钙和无镁磷酸盐缓冲盐水[PBS(-)]、甘油三酯E-test Wako、橄榄油、蔗糖、Triton X-100和5,5'-二硫代硫(2-硝基苯甲酸酯)(DTNB)购自日本大阪Wako纯化学工业有限公司。

测量老鼠的体重和内脏脂肪

6周龄小鼠免费食用含0.5%或1% GCBE的非纯化饲料(CE-2) 14天。在饲粮中添加咖啡因(0.05%和0.1%)和绿原酸(0.15%和0.3%)。每2天称重一次。实验结束时取小鼠附睾和肾周脂肪称重。奥利司他是一种治疗肥胖的药物，被用作阳性对照。

小鼠肝脏甘油三酯水平的测定

含GCBE(100和200 mg/kg·天)、咖啡因(10和20 mg/kg·天)和绿原酸(30和60 mg/kg·天)的金合欢胶(5%)混悬液每天给5周龄小鼠服用13天。第14天，取出肝脏，约200 mg的肝脏均质于1 mL PBS(-)中。然后将该悬浮液离心(2200 × g, 10分钟)，然后使用氯仿和甲醇的混合物(2:1)提取肝甘油三酯(TG)。提取液被蒸发并在1ml PBS(-)中重悬。甘油三酯E-test Wako测定甘油三酯含量。以芝麻素作为阳性对照。

橄榄油负载小鼠血清甘油三酯的测定

实验是按照下田的描述进行的等．［15］．小鼠(5 ~ 6周龄)禁食20 ~ 22小时后，从眶下静脉丛中采集初始血液样本。给小鼠注射含有GCBE(200和400 mg/kg)、咖啡因(20和40 mg/kg)和绿原酸(60和120 mg/kg)的刺槐胶(5%)混悬液。30分钟后，小鼠灌胃橄榄油(5 mL/kg)。在橄榄油加载后每隔2小时采集血液样本。样品离心，用甘油三酯E-test Wako测定血清TG。奥利司他作为阳性对照。

小鼠肝肉碱棕榈酰转移酶活性测定

6周龄小鼠分别饲喂含有GCBE(0.5%和1%)、咖啡因(0.05%和0.1%)、绿原酸(0.15%和0.3%)、新绿原酸(0.028%和0.055%)和阿魏酰奎宁酸(0.081%)混合物的饲粮(CE-2) 6 d。小鼠肝脏被取出并在含有0.25 M蔗糖和1 mM EDTA的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中均质，其重量是肝脏重量的6倍。匀浆离心(880 × g, 4℃，10 min)，收集上清;然后第二次离心(11,770 × g, 4°C)获得线粒体片段。将线粒体片段的沉淀冲洗并悬浮在缓冲液中，以获得6 mg/mL的蛋白质浓度。根据Markwell描述的方法测定CPT活性等．［16］．混合含有1.25 mM EDTA、0.1% Triton X-100和0.25 mM DTNB、37.5 μM棕榈酰CoA (20 μL)和6 mg/mL线粒体组分(20 μL)的Tris缓冲液(58 mM, pH 8.0, 1 mL)，在412 nm处记录光密度(OD) 5 min。随后加入1.25 mM l -肉碱(20 μL)，记录光密度(OD) 5 min。计算CPT活性如下:

$\text{CPT活动}（\text{nmol}/\text{最小值}/\text{毫克的蛋白质}）＝\frac{（\Delta {\text{OD}}^{\text{一个}}-\Delta {\text{OD}}^{\text{b}}）\times {20.}^{\text{c}}\times 10，000}{13，{000}^{\text{d}}\times 6^{\text{e}}}$

ΔOD^一个:加入左旋肉碱溶液后1 min光密度变化的线性

ΔOD^b:基线光密度变化1 min的线性关系

c:线粒体分数体积(μL)

d:棕榈酰辅酶a的摩尔消光系数

e:线粒体片段中蛋白质含量(mg蛋白/mL)

统计数据

结果以均数±标准差表示。采用单因素方差分析方法检验差异的显著性，然后采用Dunnett检验。结果与p< 0.05为显著性。

对小鼠体重和内脏脂肪积累的影响

GCBE治疗14天内小鼠体重和内脏脂肪含量的变化见表1．在GCBE治疗期间，饮食摄入量没有减少。GCBE(0.5%和1%)显著抑制小鼠体重。GCBE(0.5%)组小鼠附睾和肾周脂肪重量显著降低。然而，咖啡因(0.05%和0.1%)对抑制体重和内脏脂肪的效果并不显著。绿原酸(0.15%和0.3%)对体重和肾周脂肪积累的抑制作用较弱。阳性对照奥利司他(0.1%)对附睾和肾周脂肪积累有轻微抑制作用，但对体重无抑制作用。

对小鼠肝脏TG积累的影响

用GCBE、咖啡因和绿原酸治疗13天后，小鼠的肝脏TG水平降低。数字3.阐明了GCBE、咖啡因和绿原酸对肝热重的影响。GCBE和咖啡因均有抑制肝热重的趋势。此外，绿原酸(60 mg/kg·day)显著降低肝脏TG水平，提示绿原酸在GCBE治疗组具有抑制肝脏TG的作用。

橄榄油对小鼠血清甘油三酯水平升高的影响

研究了GCBE及其组分对橄榄油摄入小鼠脂肪吸收的影响。禁食22 h后血清TG水平为60 ~ 125 mg/dL。结果显示，GCBE治疗组(200和400 mg/kg)升高的血清TG水平明显降低，如图所示4．同样，咖啡因(20和40 mg/kg)对血清TG水平的升高也显示出抑制作用。然而，60和120 mg/kg浓度的绿原酸对血清TG水平没有影响。咖啡因被认为是抑制gcbe治疗小鼠脂肪吸收的贡献化合物。奥利司他(60 mg/kg)可完全抑制血清TG升高。

对小鼠肝脏CPT活性的影响

脂肪组织代谢释放的部分脂肪酸在肝细胞线粒体中转移到肝脏进行氧化过程。CPT是一种速率限制酶，催化脂肪酸运输到线粒体进行β-氧化。如图所示5GCBE(0.5%和1%)显示了肝线粒体中CPT活性的剂量依赖性增强。新绿原酸(0.028%和0.055%)和阿魏酰奎宁酸(0.081%)的混合物显著增强CPT活性。然而，咖啡因和绿原酸对肝脏线粒体中的CPT活性没有影响。阳性对照芝麻素(0.1%)可轻微增强CPT活性。

结果表明，食用GCBE 14 d对小鼠体重增加和内脏脂肪积累有抑制作用。GCBE含有10%的咖啡因和27%的绿原酸为主要成分，这些成分表现出抑制体重增加和内脏脂肪积累的趋势。因此，这些成分可能部分参与了GCBE对体重增加和内脏脂肪积累的抑制作用。已知咖啡因是一种脂聚化合物。另一方面，绿原酸对体重增加的影响尚未得到证实。Rodriguez de Sotillo和Hadley报道，静脉注射绿原酸可降低Zucker患者的血清和肝脏TG水平fa / fa大鼠(17］．然而，脂肪组织中的TG水平并没有降低。因此，绿原酸可能对肝脏TG有效，而对脂肪TG无效。在我们的研究中，纯咖啡因和绿原酸都没有显著抑制体重增加或内脏脂肪积累。最近有研究表明，绿茶中的儿茶素和咖啡因具有增强肥胖小鼠脂肪消耗的协同作用[18］．绿原酸也是一种具有抗氧化活性的膳食多酚化合物。因此，提示GCBE中的咖啡因、绿原酸和其他多酚化合物具有协同抑制小鼠体重增加和内脏脂肪积累的作用。

进一步的实验研究了GCBE和绿原酸对肝脏TG积累的影响。口服绿原酸(30和60 mg/kg·天)14天可降低小鼠肝脏TG水平。然而，内脏脂肪的数量没有变化(数据没有显示)。绿原酸对肝脏TG积累的抑制作用强于GCBE。这一结果表明，绿原酸的作用可能与GCBE的作用有关。GCBE的其他成分，如咖啡醇和咖啡醇，促进脂类合成[19]，可能引起GCBE(粗绿原酸)和纯绿原酸活性的差异。

进一步的研究促使研究GCBE对膳食脂肪吸收的抗肥胖作用，使用的小鼠是橄榄油。GCBE和咖啡因能降低橄榄油小鼠升高的血清TG水平。据报道，咖啡可以延缓胃排空。20.］通过胃近端平滑肌收缩。因此，咖啡因可以延缓脂肪吸收，从而降低升高的血清TG水平。

最后，研究了GCBE及其成分对肝脏CPT活性的影响。服用GCBE 6天后，CPT活性增强。然而，当单独使用咖啡因和绿原酸进行类似的检查时，没有观察到效果。分离出其他多酚类化合物，即新绿原酸和阿魏酰奎宁酸，并评估了它们对CPT活性的影响。新绿原酸和阿魏酰奎宁酸的化学结构与绿原酸非常相似。羧酸与咖啡酸或阿魏酸结合到奎宁酸部分的立体构型可能与活性的表达有关。尽管最新的研究表明芝麻素[21和γ-亚油酸[22]增强CPT基因表达，但只有少数报道描述了膳食多酚化合物的作用。此外，它们在CPT活性方面的结构-活性关系尚未确定。CPT对GCBE中绿原酸及其相关化合物的增强活性有待进一步研究。

我们得出结论，GCBE可抑制小鼠体重增加和内脏脂肪积累。咖啡因抑制脂肪吸收，而绿原酸及其相关化合物被发现参与了肝脏脂肪代谢的增强。

没有一个

作者和联系

1. 日本爱知县一宫新田北多町1号，稻田油脂化工有限公司研发部，邮编493-8001

   下田浩，关纪百代，aiitani道夫

相应的作者

对应到《下田Hiroshi．

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

实验由HS设计。

动物模型实验采用HS、ES和MA方法进行。

采用HS和ES法测定GCBE的成分。

手稿是HS写的。

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