meta-GNN和通路串扰在CAR-T治疗中crs相关细胞因子的研究gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

嵌合抗原受体t细胞(CAR-T)疗法是一种新型高效的细胞免疫疗法。该疗法显示出显著的疗效，但也有严重的副作用，统称为细胞因子释放综合征(CRS)。目前，一些crs相关细胞因子及其在CAR-T治疗中的作用已被实验研究证实。然而，CRS的发生机制尚不完全清楚。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

基于人类蛋白质相互作用大数据和元学习图神经网络，我们利用已知的CRS相关细胞因子，通过蛋白质相互作用全面研究CAR-T治疗中CRS相关细胞因子。随后，我们检查了119例接受CAR-T治疗的患者的临床数据，以验证我们的预测结果。最后，我们通过蛋白质相互作用网络分析、功能富集分析和通路串扰分析系统地探讨了预测细胞因子在CRS发生中的作用。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

我们发现了一些在CRS生物学过程中起重要作用的新型细胞因子，并从功能分析的角度探讨了CRS的生物学机制。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

CAR-T治疗中发现128种细胞因子及相关分子与CRS密切相关，其中IL6、IFN-γ、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1、VEGFA等重要细胞因子可能是预测CRS的关键因素。gydF4y2Ba

细胞免疫疗法是治疗肿瘤疾病的一种新的有效疗法。代表性的细胞免疫疗法是嵌合抗原受体t细胞(CAR-T)疗法。CAR-T疗法通过基因传导技术将肿瘤相关抗原结合域(通常为单链可变片段，scFv)与T细胞的杀伤机制结合在一起[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．然后将产生的CAR-T细胞注入患者体内，发挥其免疫功能并消除肿瘤细胞。该疗法在难治性b细胞白血病等疾病的治疗中表现出良好的临床效果[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

然而，CAR-T疗法的实施可能与严重甚至致命的副作用相关，统称为细胞因子释放综合征(CRS)。CRS是免疫系统激活引起的炎性细胞因子过度产生超过生理水平的直接结果。当CAR-T细胞与目标抗原接触时，它们的细胞内结构和共刺激分子CD28/CD137被激活。CAR-T细胞在短时间内增殖并迅速被激活，分泌大量细胞因子，包括白细胞介素、肿瘤坏死因子和干扰素[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．同时，巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、自然杀伤(NK)细胞和其他细胞通过CAR-T细胞分泌的细胞因子刺激被激活。这些被激活的细胞进一步释放炎症细胞因子可直接或间接参与免疫反应。然而，一旦严重的免疫反应过度，身体的正常组织和血管上皮细胞就会被破坏，患者的器官就会受损，甚至威胁生命[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

具体而言，CAR-T细胞在体内可诱导全身炎症反应并引起CRS [gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．活化的T细胞释放细胞因子和趋化因子(包括IL-2、可溶性IL-2Rα、IFN-γ [IFNG]、IL-6、可溶性IL-6R和GM-CSF)，以及单核细胞和/或巨噬细胞(分泌IL-1RA、IL-10、IL-6、IL-8、CXCL10 [IP-10]、CXCL9 [MIG]、IFN-α、CCL3 [MIP-1α]、CCL4 [MIP-1β]和可溶性IL-6R)、树突状细胞和其他细胞[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．教师等人。[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]研究了51例难治性b细胞白血病患者的细胞因子谱，包括39名儿童和12名成人。在检测的24种细胞因子中，4-5级CRS患者中IL-6、IL-8、IL-6R、MCP-1和IFN-γ的峰值水平明显高于0-3级CRS患者。此外，4-5级CRS患者的IL-6和IFN-γ水平明显高于0-3级CRS患者[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．Hay等人。[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]分析了133名接受CAR-T治疗的ALL、NHL和CLL成年患者。输注后36 h内，4级CRS患者的IFN-γ、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、MCP-1、TNFRP55和MIP-1R浓度高于其他级别CRS患者。然而，由于人体免疫系统的复杂性，这些研究的结论还不够全面。gydF4y2Ba

鉴于CAR-T治疗的免疫应答和CRS的发生涉及大量的细胞因子，有必要全面预测人体内与CRS相关的细胞因子，以了解CRS的发生机制。基于CAR-T治疗中已知的crs相关细胞因子，我们采用半监督元学习图神经网络模型，基于人类蛋白质相互作用大数据和蛋白质相互作用相似性，综合预测crs相关细胞因子。然后使用119例接受CAR-T治疗患者的临床资料验证分析结果的合理性。最后，通过蛋白相互作用网络分析、功能富集分析和通路串扰分析，系统探讨了预测细胞因子在CRS发生中的作用。该结果对于理解CRS在CAR-T治疗中的作用机制，设计有针对性的阻断措施具有重要意义。gydF4y2Ba

元学习图神经网络gydF4y2Ba

元学习在图像和文本处理领域取得了很大的进展[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．本研究使用元学习分析非欧几里得图形数据。据报道，图形神经网络也适用于图形数据的分析[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．本研究采用元学习图神经网络架构Meta-GNN构建半监督分类模型[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．通过学习少量已知的crs相关细胞因子，我们的目标是实现对crs相关细胞因子的全面预测。gydF4y2Ba

首先，基于人蛋白相互作用大数据构建人蛋白相互作用知识图谱，将知识图谱信息表示为G = (V, E, a, X)，其中V为图谱中节点的集合，E为节点之间关系的边集，a为邻接矩阵，a为图谱中节点的关系gydF4y2Ba_ijgydF4y2Ba连接边的权值是e吗gydF4y2Ba_ijgydF4y2Ba节点V的gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba和节点VgydF4y2Ba_jgydF4y2Ba(权值为0表示没有连接)，X为特征矩阵，XgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba为节点V的特征gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

元GNN模型包括共享相同GNN架构的两部分:“元学习器”和“基础学习器”。首先，元学习器采用“学习到学习”的策略学习并优化GNN模型的初始训练参数，以确保模型具有良好的泛化能力。然后通过“基础学习者”训练获得最终的GNN模型。gydF4y2Ba

本研究采用的GNN模型为二阶GCN模型。每个目标节点聚合二阶邻域的节点信息。主要过程如图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．红色箭头表示使用亚当梯度下降法来优化模型参数，gydF4y2Ba\ ({\ uptheta} \ ' \)gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba\ ({\ uptheta} \)gydF4y2Ba分别为一次元更新和所有元更新后的参数，M为元学习任务的个数。gydF4y2Ba

训练集gydF4y2BaDgydF4y2Ba_{火车gydF4y2Ba}是基于几个节点构建的gydF4y2Ba(X, Y)gydF4y2Ba与标签。元学习包括两个步骤:模型训练和模型测试。gydF4y2Ba

在模型训练阶段，从每一类训练集中随机抽取几个节点gydF4y2BaDgydF4y2Ba_{火车gydF4y2Ba}设置为gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba．然后将训练集中的其余节点设置为查询集gydF4y2Ba问gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba．元学习任务gydF4y2BaTgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba=gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba+gydF4y2Ba问gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba构造。重复上述步骤gydF4y2Ba米gydF4y2Ba生成的时间gydF4y2Ba米gydF4y2Ba元学习任务。gydF4y2Ba

让gydF4y2BaθgydF4y2Ba为模型参数(包括神经网络权重W和偏差b)。在元学习任务的执行中gydF4y2BaTgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba，目标函数为已知标签节点预测值的交叉熵函数。gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2Ba文本\ ({\ {x}} _{\文本是{}}\)gydF4y2Ba节点的输入向量是gydF4y2Ba文本\ ({\ {v}} _{\文本是{}}\)gydF4y2Ba与标签gydF4y2Ba文本\ ({\ {y}} _{\文本是{}}\)gydF4y2Ba在gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba．gydF4y2Ba然后优化参数为:gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2Bap (T)gydF4y2Ba元学习任务集和gydF4y2BaαgydF4y2Ba是学习率。gydF4y2Ba

在模型测试阶段，gydF4y2Ba问gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba利用数据对训练后的模型参数进行性能测试，避免了过拟合问题。gydF4y2Ba

优化后对GCN模型进行训练。GCN模型使用图卷积来聚合邻居节点的信息。GCN模型的本质目的是提取拓扑图的空间特征:gydF4y2Ba

其中,gydF4y2Ba\ (\ widetilde文本{一}}{\ \)gydF4y2Ba＝gydF4y2Ba\(文本{一}}{\ \)gydF4y2Ba文本\(\{+}{\文本{我}}_{\文本{N}} \)gydF4y2Ba,在那里gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba输入图的邻接矩阵和gydF4y2Ba我gydF4y2Ba_NgydF4y2Ba是单位矩阵，gydF4y2Ba\ (\ widetilde {D} \)gydF4y2Ba=ΣgydF4y2Ba_jgydF4y2Ba\ ({\ widetilde{一}}_ {ij} \)gydF4y2Ba，gydF4y2BaWgydF4y2Ba^{(左)gydF4y2Ba}为可训练权值，σ(·)为激活函数。gydF4y2BaHgydF4y2Ba^{(左)gydF4y2Ba}∈gydF4y2BaRgydF4y2Ba^{NgydF4y2Ba×gydF4y2BaDgydF4y2Ba}节点的隐层嵌入是gydF4y2Bal -gydF4y2Ba第Th层，最初gydF4y2BaHgydF4y2Ba^{（0)gydF4y2Ba}=gydF4y2BaXgydF4y2Ba表示节点的特征矩阵。gydF4y2Ba

GCN模型的整体前向传播公式描述为:gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2BaZgydF4y2Ba表示网络的输出，gydF4y2BaXgydF4y2Ba为节点的特征矩阵，gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba是邻接矩阵，gydF4y2BaWgydF4y2Ba^{（0)gydF4y2Ba}而且gydF4y2BaWgydF4y2Ba^{(1）gydF4y2Ba}为可训练权重矩阵，使用ReLU和Softmax作为激活函数。gydF4y2Ba

在训练过程中，交叉熵函数如式(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)作为目标函数。具体的训练方法有梯度下降法和误差反向传播法。gydF4y2Ba

经过训练后，GCN模型可以用来预测知识地图中未知的类节点。gydF4y2Ba

细胞因子的预测gydF4y2Ba

人体细胞因子数据来自NCBI网站(gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/gydF4y2Ba)．这些数据包括细胞因子、趋化因子和可溶性受体(统称为“细胞因子”)，共1769个样本。这些细胞因子的相互作用数据从String数据库(gydF4y2Bahttps://string-db.org/gydF4y2Ba)，涉及1615种细胞因子的62,576个相互作用数据。我们还提供了一份补充文件(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，并提供详细的实施详情。在此基础上构建拓扑图，形成表征细胞因子节点间相互作用的邻接矩阵。这里将细胞因子节点的特征矩阵设为单位矩阵。gydF4y2Ba

通过文献挖掘，我们获得了20个证实与CRS相关的细胞因子阳性数据，分别是CXCL8/IL-8、IL-17A、CXCL10/IP-10、CXCL9/MIG、CCL4/MIP-1B、CCL3/MIP-1A、CCL2/MCP-1、IL-1A、IL-1B、TNF-α、IL-2、CSF2/GM-CSF、IL-2RA、IL-5、IL-15、TNFRSF1A、IL-4、IL-13、IL-23A、ANGPT2gydF4y2Ba/gydF4y2BaANG2。除阳性数据外，我们选取了100个细胞因子作为阴性数据，这些细胞因子在拓扑图上的节点距离阳性节点最远。由于与CRS相关的细胞因子相比，更多的细胞因子与CRS无关，因此选择更多的阴性数据以减少假阳性。gydF4y2Ba

将邻接矩阵、特征矩阵(单位矩阵)、正负标签数据放入Meta-GNN进行模型训练。训练模型后，我们可以得到与CRS相关的所有节点的概率。在保持正标签数据不变的情况下，将负标签数据进行到预测概率最小的最后100个数据，再次进行模型训练，直至预测结果收敛。gydF4y2Ba

为避免初始数据选择对预测结果的影响，随机选取100个阴性标签数据，重复上述预测过程。这个过程要重复1000次。最后，根据与CRS相关的预测概率，将预测结果由大到小排列，将1000个预测结果的中值作为每个细胞因子的最终预测结果。预测结果如图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．共选取概率值大于0.95的128个细胞因子及相关分子作为CRS相关的细胞因子。gydF4y2Ba

XGBoost验证gydF4y2Ba

收集119例接受CAR-T治疗的B-ALL患者的临床资料，详细资料见表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．数据根据CRS水平分组。gydF4y2Ba

XGBoost [gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]算法通常用于分类分析。我们用它来评估每种类型的数据对CRS的贡献。gydF4y2Ba

功能富集分析gydF4y2Ba

我们对预测的细胞因子进行KEGG通路富集分析和GO富集分析，统称为功能富集分析[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．通过功能富集分析，我们不仅发现了以往权威研究中发现的MAPK、NF-KB、JAK-STAT3、mTOR等通路[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]，同时也解释了其他通路的联合作用，如VEGF通路和nod样受体通路。通过对这些途径的分析，我们试图探索CRS是如何发生的，从而使人们更清楚地了解CRS发生的机制。这些通路中频率较高的细胞因子也表明了影响CRS的重要性，如上文提到的IFN-γ、IL1B、IL6和TNF-α。这些因子与VEGF通路中的血管炎症因子ICAM-1、VCAM-1、VEGFA相呼应，共同促进CRS的进展。gydF4y2Ba

通路串扰分析gydF4y2Ba

在crs相关细胞因子富集分析的基础上，分析crs相关细胞因子的串扰。该分析基于以下假设:共享一定比例细胞因子的两条通路被认为存在串扰[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

为了描述一对通路之间的串扰程度，可以计算两个测量值，即Jaccard系数(JC)。gydF4y2Ba\(= \左|{\压裂{\帽B}{{一杯\ B}}} \右| \)gydF4y2Ba重叠系数(OC)gydF4y2Ba\(= \压裂{{\左|{\帽B} \右|}}{{\敏\离开({\左| \ |,左| \ B \ |} \右)}}\)gydF4y2Ba，其中A和B为两条通路中包含的细胞因子列表。gydF4y2Ba

具体步骤如下:gydF4y2Ba

1. (1）gydF4y2Ba

   在选择一对富集通路时，每条富集通路的FDR值应小于0.05，且通路中富集的细胞因子应大于5个，因为细胞因子过少可能缺乏足够的生物学信息。gydF4y2Ba

2. （2）gydF4y2Ba

   计算两种途径共享的相关细胞因子的数量。任何共享细胞因子少于4个的通路对都被移除。gydF4y2Ba

3. （3）gydF4y2Ba

   对于所有符合条件的路径对，计算JC系数与OC系数之和的平均值。gydF4y2Ba

4. （4）gydF4y2Ba

   为了减少假阳性，选择均值大于0.3的通路进行分析。gydF4y2Ba

5. （5）gydF4y2Ba

   可视筛选通路对，直观显示它们的串扰[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

预测结果gydF4y2Ba

Meta-GNN模型预测的结果以概率的形式表示。概率越高，与阳性标签数据的相似度越高，与CRS的关系越密切。预测结果如表所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．在CAR-T治疗中，共发现128个蛋白质与CRS密切相关。gydF4y2Ba

临床数据验证gydF4y2Ba

收集119例患者的临床资料包括四类:细胞因子表达资料、凝血试验资料、生化试验资料和血常规试验资料(表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．在用XGBoost进行贡献分析前，剔除了与CRS密切相关的3种细胞因子(IL10、IL6和IFN-γ)，不作为阳性数据。从分析结果来看，这三种细胞因子均排名靠前，说明预测结果的可靠性。gydF4y2Ba

在此过程中，我们计算了CAR-T治疗第0天到记录最后一天(约7天)的所有数据的平均值，分析与患者CRS水平的关系。gydF4y2Ba

采用XGBoost算法进行分类分析，分析各类型数据对CRS预测最高水平的贡献。本研究采用五重交叉验证，结果用特征的重要性表示，如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba．高概率表明相应的数据对CRS预测有很大的贡献(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba除IL-4外，IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ和IL-17A均有助于预测最高CRS水平。其中，IL-6对结果的贡献最大，il - 10和IFN-γ的贡献显著。这说明三种细胞因子与CRS呈正相关。虽然不被视为正标签数据，但在神经图网络的预测结果中排名较高，从而证明了预测结果的合理性(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

我们还在结果中加入了一些酶。这些酶与器官损伤有关。例如，高水平的LDH常出现在3-4级神经毒性淋巴瘤患者中，且与无进展生存期呈负相关[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．这些结果与CRS的症状一致。gydF4y2Ba

功能分析gydF4y2Ba

首先，我们对128个细胞因子和相关分子进行了网络分析。随后进行通路分析和氧化石墨烯富集分析。Fisher精确检验用于显示通路和输入基因之间的重叠显著性。分析结果中，FDR值小于0.05认为富集显著。结果揭示了细胞因子的主要作用途径和生物学功能。最后，提取细胞因子通路进行串扰分析，并从直观的角度进一步解释CRS的发生机制。gydF4y2Ba

蛋白质相互作用网络分析gydF4y2Ba

利用Cytoscape绘制了128个细胞因子与相关分子的网络相互作用图(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2BaA、交互图大致可以分为左右两个模块。左侧模块主要由趋化因子组成，右侧模块主要由白介素和可溶性受体组成。gydF4y2Ba

各部分所含的细胞因子关系密切，联系紧密。数字gydF4y2Ba4gydF4y2BaB显示了涉及趋化因子的部分。趋化因子是一类促进各种免疫细胞功能的细胞因子，包括白细胞的募集和运输。炎症过程中的转运障碍与过度的炎症反应有关。数字gydF4y2Ba4gydF4y2Bac主要包括IL-2Rα/IL-2RA、IFN-γ/IFNG、IL-6、IL-6R、GM-CSF/CSF2 [gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．该模块对应于许多参与CRS反应的细胞因子。可溶性IL-6与IL-6R结合形成IL-6和IL-6R复合物，并与gp130结合，随后通过细胞内结构域启动信号转导。信号转导由JAK-STAT3、PI3K-AKT和MAPK通路介导[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．数字gydF4y2Ba4gydF4y2Bad为toll样受体(TLRs)。TLRs与其配体之间的相互作用通过TIR结构域和各种介质诱导级联激活，如髓样分化蛋白88 (MyD88)、TIR结构域含蛋白(TIRAP)、TIR受体诱导干扰素(TRIF)、trir相关分子(TRAM)和一些酪氨酸激酶。由于这些信号级联，NF-κB等转录因子可以诱导炎症细胞因子的产生[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．数字gydF4y2Ba4gydF4y2Bae, f表示由JAK1和JAK2连接的模块。其中与CRS密切相关的IL-23包括IL-23A和IL-12B，与IL-12共享。IL-23与克罗恩病、类风湿性关节炎、牛皮癣等免疫介导炎症性疾病有关[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．TNF是一种有效的多功能促炎细胞因子，属于由TNF及其受体如TNFRSF1A和TNFRSF1B组成的超家族。除了诱导发热、增强全身炎症和激活抗菌反应(如IL-6的产生)外，TNF还可以诱导细胞凋亡和调节免疫。TNF及TNF和TNF受体超家族中的其他细胞因子是NF-κB的有效诱导物，从而导致多种促炎基因的表达[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．数字gydF4y2Ba4gydF4y2Bag为IL-1及其受体。CRS发病时收集的髓系细胞类型RNAseq数据显示，IL-1R1在肿瘤相关髓系细胞中上调，而在脾髓系细胞中仅检测到IL-1R2 [gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．阻断IL-1可降低CRS和神经毒性[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

这六个模块并不是相互隔离的。相反，它们通过特定的细胞因子与一个大模块密切相关。gydF4y2Ba

功能富集分析gydF4y2Ba

丰富了涉及细胞因子的途径和主要生物学过程。在通路分析中，共有49条通路被富集。选取了47条FDR值小于0.05的重要通路如图所示。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa.在生物过程中，我们选择了前40个，如图所示。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab. FDR值低的颜色倾向于蓝色，FDR值高的颜色倾向于红色。圆圈的大小表示细胞因子的数量。所选择的途径和生物学过程为理解CRS的发生机制提供了重要信息。gydF4y2Ba

如图所示。gydF4y2Ba5gydF4y2BaA，所选择的通路大多与炎症反应及相关疾病相关，其中有几个尤其突出。例如，“细胞因子受体相互作用途径”是最重要的，反映了生命活动中必不可少的途径。该途径与癌症、自身免疫性疾病、代谢性疾病等疾病密切相关[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．JAK-STAT信号通路与第一条通路相连，是细胞因子信号转导的重要通路。它被多种细胞因子、生长因子和受体激活，并参与细胞增殖、分化、凋亡、血管生成和免疫调节[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．还选择了其他与炎症疾病相关的途径。gydF4y2Ba

在无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2BaB，选择了许多与人体炎症反应相关的术语，包括趋化因子反应的正向调控、免疫反应、细胞对脂多糖的反应。这些发现与CRS是炎症反应的事实是一致的。gydF4y2Ba

通路串扰分析gydF4y2Ba

为了进一步突出通路富集的细节，了解通路之间的相互作用，我们对47个显著富集的通路进行了通路串扰分析。其中45条路径符合串扰分析标准。具体而言，每条通路与一条或多条其他通路共享至少4个基因，且FDR值小于0.05。为了降低假阳性率，我们选择了平均JC和OC值均大于0.3的通路对。45条通路中保留了306条通路对。gydF4y2Ba

根据它们的串扰，可以将路径分为左模块和右模块。每个模块比其他模块包含更多的相互作用，表明它们可能参与相同或相似的生物过程。在无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2BaA，图线的宽度和粗细与路径之间的相互作用程度有关。高水平的互动对应粗线，而低水平的互动对应细线[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．右侧模块主要与炎症反应和疾病通路相关，如PI3K-AKT信号转导、toll样受体信号转导、NF-κB信号转导、JAK-STAT信号通路、炎症性肠病、丙型肝炎等。左侧模块主要与免疫反应通路相关，如系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺疾病、产生IgA的肠道免疫网络等。这些发现与CAR-T疗法的副作用一致。频率最高的前20个细胞因子及其通路如图所示。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab, c.细胞因子的高频率表明它们的重要性。gydF4y2Ba

近年来，通过对患者临床症状的获取和监测数据，研究人员了解了CAR-T治疗产生CRS的发病机制。随着高通量技术的发展，某些细胞因子逐渐被确定与疾病有关。然而，在分子水平上全面了解CRS发病机制的生物学过程尚未建立。一些相关的细胞因子尚未发现。因此，有必要在系统生物学水平上探讨CRS的发病机制及相关细胞因子[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

本文所采用的系统分析方法具有显著的优势。首先，我们收集了一套全面的人类细胞因子，为进一步分析提供了有价值的来源。此外，我们使用Meta-GNN作为神经图网络。该方法适用于本研究中的小样本量预测，因为它可以根据已知与CRS密切相关的细胞因子作为阳性标记，预测一些可能与CRS密切相关的细胞因子。随后，我们获得了119例接受CAR-T治疗的b淋巴细胞白血病患者的数据，以进行特征筛查。我们应用XGBoost算法对实验数据中测量特征的重要性进行排序，并验证了预测结果的准确性。最后，我们选择阳性标签，并预测可能与CRS密切相关的细胞因子进行后续分析。我们提供了一个全面和系统的框架来描述CAR-T治疗过程中产生的CRS的生物学过程和功能特征。gydF4y2Ba

细胞因子分析主要显示与细胞因子密切相关的模块，如趋化因子、toll样受体、白介素等。这些细胞因子在CRS的发生发展中起着重要作用。gydF4y2Ba

GO分析主要丰富了CRS相关的生物学过程，其中炎症反应最为突出。例子包括细胞因子、趋化因子介导的反应和细胞对LPS的反应。白介素家族和趋化因子家族的成员可以增加CAR-T细胞的增殖和激活，为炎症反应提供正反馈。脂多糖被认为是CAR-T治疗诱导的CRS的关键炎症标志物[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．此外，对T细胞增殖有正向调节作用。CAR-T疗法通过T细胞增殖维持肿瘤杀伤能力。T细胞的大量增加与CRS的高风险有关，这与之前的发现一致。gydF4y2Ba

途径分析显示，JAK-STAT信号通路、趋化因子信号通路、TNF信号通路、toll样受体信号通路、NF-κB信号通路富集。这些与炎症相关的通路富集，FDR值较低。结果表明，CRS中有多种细胞因子参与，与CRS在病理发展中的情况一致。一些疾病相关的途径可能有助于CRS的早期，如炎症性肠病、乙型肝炎、丙型肝炎和类风湿性关节炎。路径交互模块主要分为两个模块。一个模块主要与炎症反应和疾病途径有关，另一个模块主要与免疫反应途径和这些途径引起的疾病有关。一系列炎症和免疫信号通路的激活可以调节人体的各种生理过程，并对患者造成损害。gydF4y2Ba

CAR-T细胞进入人体后，直接导致肿瘤细胞燃烧，细胞内的能量分子ATP大量释放，ATP可以强烈激活巨噬细胞[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．巨噬细胞通过诱导酪氨酸激酶附近的TCR活化来促进信号复合物的组装，从而激活下游信号通路，如MAPK、PKC和钙离子。这些都促进转录因子NF-κB的活性，调控效应蛋白分子的表达，从而增强T细胞对肿瘤的杀伤力，导致更多细胞因子的释放[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．释放的细胞因子激活了JAK-STAT通路，它作为应激的炎症信号通路，并具有快速反应。该途径涉及IL-6ST (gp130)受体家族。IL-6结合导致受体二聚，并激活其与JAK蛋白的结合。被激活的JAK蛋白同时磷酸化受体和自身。这些磷酸化位点是STAT蛋白和具有SH2结构的接头蛋白的结合位点。适配器蛋白将受体与MAPK, PI3K-AKT和其他通路连接[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

随后，toll样受体和nod样受体(NLRs)分别作为细胞外和细胞内模式识别受体在炎症中发挥重要作用。Toll/IL-1R (TIR)结构域通过MyD88激活转录因子NF-κB和MAPK通路，从而激活TLR信号转导通路。当CAR-T细胞攻击肿瘤细胞时，它们会导致肿瘤细胞死亡并释放抗原。当toll样受体识别病原体相关分子模式(PAMPs)时，它们激活NF-κB以引发炎症反应。此外，当炎症发生时，炎症反应释放的LPS通过TLR4诱导一系列基因表达。抗病毒细胞因子如CD80、CD86和IFN-β的表达受myd88独立途径的影响，该途径参与炎症和免疫反应。nod样受体通路中的NOD1和NOD2蛋白与其配体结合后，与RIP2相互作用磷酸化IKB，从而激活转录因子NF-κB介导炎症介质的表达[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．NF-κB通路的激活调控一系列基因的表达，包括ICAM-1、VCAM-1、SELE、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、MCP-1、IL-8、IL-12、IFN-β，以及一些受体分子如IL-2R和T细胞受体α、β链的表达[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．TNF-α、IL-1和其他炎症介质激活不同的MAPK通路并介导炎症反应[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

TLR/NF-κB通路是诱导炎症的关键环节。LPS刺激人脐静脉内皮细胞时，TLR4表达上调，导致TLR4活性升高。NF-κB成分RELA在调控中发挥重要作用。NF-κB1在TLR/NF-κB通路中也有重要作用。LPS通过TLR4激活NF-κB1，继而产生一系列炎症介质，导致损伤组织和细胞的炎症反应[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．这些观察结果表明，CRS与该通路有密切关系。gydF4y2Ba

从血管内皮细胞角度看，ICAM-1、VCAM-1、SELE与白细胞表面配体结合，介导白细胞粘附，进而诱导白细胞聚集和浸润。这引起局部炎症和微血管内皮细胞损伤，进而促进VWF的表达。血管损伤后，NO自由基被释放。NO生成异常导致血管舒张和低血压，是CRS的常见临床特征[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．先前的研究进一步发现，在严重CRS中，内皮细胞激活导致VWF和Ang2等生物标志物水平升高，与严重CRS中血管不稳定、毛细血管渗漏和消耗性凝血障碍的表现一致[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．活化的内皮细胞是CRS中IL-6的重要来源。激活血管内皮细胞的生物标志物可以帮助确定哪些患者存在最大的CRS和神经毒性风险。一般情况下，正常血管中ICAM-1和VCAM-1的表达不能用标准的免疫组化方法检测。然而，在血管损伤或炎症因子刺激的条件下，ICAM-1和VCAM-1不仅在VECs上呈时间依赖性表达，还介导单核细胞粘附内皮细胞，促进炎症的发展[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．有报道称，炎症反应期的内皮细胞分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGFA)介导NF-κB的活化，从而促进ICAM-1和VCAM-1的表达。有研究者进一步证实NF-κB对ICAM-1和VCAM-1表达的调控作用，并发现NF-κB的激活和消退先于ICAM-1和VCAM-1的激活和消退。这些结果表明，ICAM-1、VCAM-1和VEGFA是预测CRS的关键因素。gydF4y2Ba

在细胞凋亡方面，血管内皮细胞的凋亡在CRS发生过程中受到抑制。其中，PI3K-AKT信号转导通路的激活抑制了细胞凋亡，在炎症、肿瘤发展、代谢等疾病的发病机制和凋亡机制中起着重要作用。当PI3K-AKT信号转导通路被激活时，活化的Akt会增加NF-κB的含量，激活NF-κB通路。PI3K-AKT信号转导通路通过一系列反应上调TNF-α等基因的转录水平。TNF-α促进其他细胞因子的产生和释放，最终形成细胞因子网络，扩大炎症连锁反应。TNF-α、IFN-γ等细胞因子诱导的细胞凋亡依赖于PI3K-AKT通路。细胞凋亡在CRS的消退中起重要作用。PI3K-AKT信号转导途径抑制T细胞和血管内皮细胞凋亡，促进炎症状态的持续，为CRS的持久性提供了有力的见解[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

CRS中的级联反应是CRS发生的主要原因之一。我们分析了CRS涉及的一些主要炎症途径，并指出了与CRS密切相关的某些细胞因子和蛋白质。我们还讨论了它们在CRS发生中的作用，为今后阻断和减弱CRS的研究提供了重要的见解和帮助。gydF4y2Ba

CAR-T治疗期间CRS的发展是复杂的，与许多因素有关。在本研究中，我们应用元图神经网络框架、机器学习算法和系统生物学分析来确定CRS的原因，并在预测结果中识别概率超过0.95的细胞因子。通过PPI分析、功能富集分析和通路串扰分析，我们确定了与CRS相关的生物学过程和通路模块，以解释CRS的原因。我们的预测结果为CRS提供了有意义的推断，并具有识别潜在相关细胞因子的价值。这些结果为在系统生物学水平上分析CRS机制提供了广阔的前景。随着高通量技术的发展和医学实验的增多，实验结果中实际有用的细胞因子将不可避免地出现在我们预测和分析的结果中。gydF4y2Ba

研究中使用的细胞因子来自NCBI(gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/gydF4y2Ba）;本研究中使用的交互来自STRING数据库(gydF4y2Bahttps://cn.string-db.org/gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

中国国家自然科学基金(621721121,82073800)资助。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 魏振宇与程琦并列第一作者gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 哈尔滨工程大学智能系统科学与工程学院，智能系统与生物信息研究所，黑龙江哈尔滨150001gydF4y2Ba

   魏振宇，程琦，赵成奎，徐佳玉，冯伟星gydF4y2Ba

2. 华东师范大学生物医学工程与技术研究所，化学与分子工程学院，上海市分子治疗与新药开发工程研究中心，上海市中山北路3663号，200065gydF4y2Ba

   徐楠，康丽青，楼晓燕，于磊gydF4y2Ba

3. 上海Unicar-Therapy生物医药科技有限公司，上海gydF4y2Ba

   徐楠，康丽青，楼晓燕，于磊gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

WF和LY提供了想法和指导。ZW、QC、NX设计实施并撰写稿件。JX, LK和XL协助进行生物验证分析。所有作者审阅并批准了手稿的最终版本。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaLei余gydF4y2Ba或gydF4y2Ba冯史gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

本研究得到了苏州大学附属第一人民医院伦理委员会的批准。我们已收到参与本研究的个别患者的知情同意书。所有的方法都按照相关的指导方针和规定进行。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

我们没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

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