评价α-半乳糖神经酰胺作为猪流感减毒活疫苗的佐剂gydF4y2Ba

糖脂配体α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)激活的自然杀伤T (NKT)细胞刺激多种免疫细胞，增强疫苗介导的免疫应答。一些研究已将这种方法用于辅助灭活和亚单位甲型流感病毒(IAV)疫苗，包括增强交叉保护性流感免疫。然而，α-GalCer是否能增强减毒流感病毒(LAIV)活疫苗尚不清楚，与非复制流感疫苗相比，LAIV疫苗通常能诱导更好的异源免疫和异亚型免疫。目前的研究使用猪流感挑战模型来评估α-GalCer是否可以增强由编码截断NS1蛋白的重组H3N2 LAIV疫苗(TX98ΔNS1)引起的交叉保护免疫反应。在一项研究中，断奶猪分别接种H3N2 TX98ΔNS1 LAIV疫苗和0、10、50和100 μg/kg剂量的α-GalCer，随后用异源H3N2病毒攻毒。所有治疗组均不受感染。然而，α-GalCer的加入似乎可以抑制LAIV疫苗的鼻脱落。在另一项实验中，用H3N2 LAIV接种猪，加或不加50 μg/kg α-GalCer，以异亚型大流行性H1N1病毒攻击。单独接种LAIV疫苗的猪产生交叉反应性体液和细胞反应，阻断病毒在呼吸道中的复制，并显著减少病毒脱落。另一方面，将疫苗与α-GalCer联合使用降低了交叉保护细胞和抗体反应，并导致呼吸道组织中病毒滴度升高。 These findings suggest that: (i) high doses of α-GalCer impair the replication and nasal shedding of the LAIV vaccine; and (ii) α-GalCer might interfere with heterosubtypic cross-protective immune responses. This research raise concerns that should be considered before trying to use NKT cell agonists as a possible adjuvant approach for LAIV vaccines.

甲型流感病毒(IAVs)是人类和动物健康的重要病原体(Ito et al。gydF4y2Ba1998gydF4y2Ba；Ma等人。gydF4y2Ba2009gydF4y2Ba；Tong等。gydF4y2Ba2012gydF4y2Ba；Long等人。gydF4y2Ba2019gydF4y2Ba)．接种疫苗是控制人类以及家禽和猪等易感染室内室内病毒的牲畜的关键组成部分。在美国，有三种不同的疫苗可供人类使用:(i)可注射的三价或四价灭活流感病毒疫苗制剂(全病毒、分裂病毒或亚单位)(Barberis等。gydF4y2Ba2016gydF4y2Ba；Gouma等人。gydF4y2Ba2020gydF4y2Ba）;(二)可注射的重组血凝素疫苗(杨l.p.gydF4y2Ba2013gydF4y2Ba）;(三)鼻内喷雾剂(Maassab)接种减毒流感病毒活疫苗gydF4y2Ba1967gydF4y2Ba；Roubidoux和Schultz-CherrygydF4y2Ba2021gydF4y2Ba；USFDAgydF4y2Ba2018gydF4y2Ba)．灭活疫苗的生产相对简单和经济。然而，它们对异源和异亚型IAV毒株几乎没有交叉保护，并且循环IAV与疫苗毒株的不匹配通常导致疫苗效力低(Flannery et al.)。gydF4y2Ba2019gydF4y2Ba；勒纳德和科贝gydF4y2Ba2018gydF4y2Ba)．LAIV疫苗对异源和异亚型病毒毒株提供了更好的交叉保护，因为它们诱导了交叉反应性抗体和T细胞，这些抗体和T细胞可以识别流感病毒的保守内部成分(Beyer et al.)。gydF4y2Ba2002gydF4y2Ba；霍夫特等人。gydF4y2Ba2011gydF4y2Ba)．然而，经美国食品和药物管理局批准用于人类的冷适应性LAIV疫苗必须定期重新配制，而且疫苗与流行病毒株的意外不匹配会将有效性降低到50%以下(Caspard et al.)。gydF4y2Ba2017gydF4y2Ba)．因此，迫切需要通过诱导长期异亚型免疫使LAIV疫苗更有效。gydF4y2Ba

佐剂的使用可以显著提高IAV疫苗提供的交叉保护异源免疫。然而，传统佐剂很少能提高对异亚型IAV毒株的交叉保护免疫(Tricco等。gydF4y2Ba2013gydF4y2Ba；Gouma等人。gydF4y2Ba2020gydF4y2Ba)．此外，由于阻碍佐剂吸收的物理和化学障碍以及粘膜表面优先诱导耐受，通常不推荐用于粘膜疫苗(Tregoning等)。gydF4y2Ba2018gydF4y2Ba)．此外，它们似乎增加了贝尔氏麻痹的风险，贝尔氏麻痹被认为是由颅面神经炎症引起的(Mutsch等。gydF4y2Ba2004gydF4y2Ba)．研究人员已经探索了几种策略来克服这些障碍，包括使用α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)，这是一种糖脂分子，可以有效激活不变的自然杀伤T细胞(NKT)。这些细胞是T淋巴细胞的一个子集，可以识别与CD1d分子结合的糖脂抗原，并可以刺激各种先天和适应性免疫功能，包括肺部的免疫反应(Bendelac等。gydF4y2Ba2007gydF4y2Ba；Cerundolo等人。gydF4y2Ba2009gydF4y2Ba)．大量小鼠研究表明，α-GalCer或该分子的衍生物的激活会刺激NKT细胞产生CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT帮助者样免疫反应对抗多种共递送抗原(Van Kaer et al。gydF4y2Ba2011gydF4y2Ba；Brennan等人。gydF4y2Ba2013gydF4y2Ba；李等人。gydF4y2Ba2010gydF4y2Ba；沙利文等人。gydF4y2Ba2010gydF4y2Ba)．此外，这些反应似乎避免了与其他类型的粘膜佐剂相关的神经元炎症类型(Youn等。gydF4y2Ba2007gydF4y2Ba)．多种灭活的IAV病毒和基于肽的IAV疫苗已被α-GalCer衍生物佐剂(Ko等。gydF4y2Ba2005gydF4y2Ba；尤等人。gydF4y2Ba2007gydF4y2Ba；Kamijuku等。gydF4y2Ba2008gydF4y2Ba)．Kopecky-Bromberg等人(gydF4y2Ba2009gydF4y2Ba)已经证明该方法还可以提高LAIVs在经鼻内接种α-GalCer衍生物α- c -半乳糖神经酰胺(α-C-GalCer)的BALB/c小鼠中的疗效;与单独接种疫苗的小鼠相比，接种编码截断NS1蛋白的LAIV疫苗的小鼠发病率和死亡率降低(Kopecky-Bromberg et al.)。gydF4y2Ba2009gydF4y2Ba)．尽管这些结果很有希望，但尚不清楚α- galcer介导的NKT细胞刺激是否是增强人类LAIV疫苗的可行方法，因为小鼠不是iav的天然宿主，而且小鼠NKT细胞频率和组织分布与人类有很大差异。此外，据报道，高剂量α-GalCer可降低LAIV疫苗的复制，从而损害免疫保护(Kopecky-Bromberg et al.)。gydF4y2Ba2009gydF4y2Ba；Artiaga等人。gydF4y2Ba2016 bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

因此，本研究的目标是利用猪流感挑战模型研究α-GalCer作为LAIV疫苗佐剂的潜力。猪非常适合这一目的，因为(i)它们是与人类相同的iav的天然宿主，(ii)它们反映了人类的临床症状，(iii)它们比小鼠更接近人类的解剖学和发病机制(Starbæk等人)。gydF4y2Ba2018gydF4y2Ba)．此外，(iv)与人类相比，猪表达NKT细胞的频率和组织分布相似(Artiaga等。gydF4y2Ba2014gydF4y2Ba；Yang等。gydF4y2Ba2017gydF4y2Ba)．总的来说，我们发现，用α-GalCer佐剂重组H3N2 LAIV疫苗，矛盾地削弱了通常由该疫苗对异亚型H1N1病毒挑战提供的交叉保护免疫。这一结果对使用这种方法佐剂人猪LAIV疫苗提出了警告。gydF4y2Ba

laiv免疫猪对不同α-GalCer剂量的反应gydF4y2Ba

高剂量α-GalCer已被证明可降低LAIV疫苗的效力，可能是通过刺激抑制病毒复制的免疫反应(Kopecky-Bromberg等)。gydF4y2Ba2009gydF4y2Ba)．因此，我们进行了一项猪流感疫苗挑战实验(实验1)，以确定避免抑制疫苗病毒生长的α-GalCer剂量。猪鼻内接种编码截断NS1蛋白的H3N2 A/Swine/Texas/4199-2/1998 (TX98) IAV (TX98ΔNS1) (Solórzano等。gydF4y2Ba2005gydF4y2Ba)，与0(仅为载液)、10、50或100 μg/kg α-GalCer联合作用(表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，附加图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).另一对照组接种假疫苗。所有猪在接种疫苗后28天(d.p.v.)接种异种H3N2 a /Swine/Colorado/23619/1999 (CO99)病毒，并在感染后5天(d.p.v.)实施安乐死。接种疫苗和α- galcer治疗的动物在整个28天的疫苗接种期均未观察到任何不良反应。gydF4y2Ba

在用异源H3N2 CO99病毒攻击后，未接种疫苗的猪组在整个5天的攻击期间比接种疫苗的猪有更高的平均体温(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).虽然不显著，但与0和10 μg/kg α-GalCer剂量组相比，50或100 μg/kg α-GalCer剂量组LAIV脱落的发生率延迟(图5)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).此外，与未接种α-GalCer的猪相比，50和100 μg/kg剂量的α-GalCer在3和5 d.p.v.时，鼻拭子中TX98ΔNS1病毒滴度降低了约1-2 log(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac). 10 μg/kg剂量α-GalCer也能减少病毒脱落，但仅为5 d.p.v。在攻毒期间，任何接种猪的鼻拭子或支气管肺泡灌洗液(BALF)中均未检测到病毒，无论α-GalCer剂量如何(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba罪犯)。gydF4y2Ba

无论α-GalCer的剂量如何，LAIV疫苗接种可诱导血清中H3N2 tx98特异性血凝抑制(HI)的高滴度(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bae).用CO99刺激接种猪提高了tx98特异性HI滴度(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bae). H3N2 CO99挑战也诱导了适度的CO99特异性HI滴度(5d.p.i.)，这在接种疫苗的猪和未接种疫苗的猪之间相似(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baf)。gydF4y2Ba

H3N2 CO99感染引起轻度肺部病变，主要影响右肺中叶。假疫苗接种的猪有最高水平的宏观病变(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bag).与单独接种LAIV疫苗的猪相比，没有一种α-GalCer治疗显著降低了肺病理。事实上，与其他接种组相比，100 μg/kg α-GalCer接种组的肺病理评分更高。gydF4y2Ba

总的来说，这些结果表明LAIV疫苗可以保护猪免受异源CO99病毒的感染。他们还表明，尽管降低了鼻拭子中LAIV的水平，但α-GalCer的注射并没有损害疫苗清除挑战病毒的能力。100 μg/kg α-GalCer免疫组肺病理评分最高。因此，我们选择50 μg/kg剂量，在我们的第二个实验中测试α-GalCer增强LAIV疫苗对异亚型IAV病毒攻击的佐剂保护潜力。gydF4y2Ba

α-GalCer与未接种laiv疫苗的猪对异亚型挑战的反应gydF4y2Ba

临床体征和免疫学gydF4y2Ba

在实验2中，猪分别接种H3N2 LAIV TX98ΔNS1，单独接种或与50 μg/kg α-GalCer联合接种，21天后分别接种同源野生型TX98病毒或异亚型大流行H1N1 A/California/04/2009 (CA04)病毒(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba；额外的无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).在整个21天的接种期，接种疫苗的动物和α- galcer处理的动物均未观察到不良反应。攻毒后，三组ca04感染猪的体温升高1d.p.i，未接种TX98感染猪的体温升高3d.p.i。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa). TX98ΔNS1接种了同源H3N2 TX98病毒的猪在任何测试时间点都没有发热。gydF4y2Ba

实验2采用流式细胞术比较不同处理组间血液、BALF、肺组织、气管支气管淋巴结(TBLN)中白细胞数量的频率。与其他治疗组相比，接受α-GalCer的猪外周血中NKT细胞频率在20d.p.v.和5d.p.i.时更高，BALF、肺组织和TBLN中NKT细胞频率在5d.p.i.时也更高。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba然而，在不同治疗组中，其他类型的T细胞亚群、自然杀伤细胞(NK)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或粒细胞的频率没有检测到差异(附加图)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

血清学gydF4y2Ba

疫苗接种诱导tx98特异性HI滴度为14 d.p.v.，并一直维持到攻毒期结束(5 d.p.v.)(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).在21天的疫苗接种期间，疫苗没有诱导出ca04特异性HI滴度。感染后，ca04 -特异性HI滴度最高的是用H3N2 LAIV接种但未加α-GalCer处理的ca04 -感染猪。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).与单独接种LAIV疫苗的猪相比，接种α-GalCer疫苗的猪具有较低的ca04特异性HI滴度(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).这些结果表明TX98ΔNS1 LAIV疫苗具有适度的诱导交叉反应的ca04特异性抗体的能力，并且α-GalCer与LAIV疫苗结合后，这些抗体的浓度在数值上降低了。gydF4y2Ba

细胞反应gydF4y2Ba

采用干扰素-γ酶联免疫吸附斑点法(ELISPOT)检测免疫接种和α-GalCer对同源和异亚型细胞免疫应答的影响。未接种疫苗的猪直到5d.p.i才产生可测量的TX98或ca04特异性外周血单个核细胞(PBMC)。相比之下，接种laiv疫苗的猪开始以20个d.p.v呈现TX98-和ca04 -反应性PBMC。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa和b)。与未接种疫苗的猪相比，在未接种α-GalCer疫苗的猪中，TX98感染诱导了ca04 -反应细胞的适度增加，并且对TX98反应细胞的频率没有影响。相比之下，我们发现在接种了不含α-GalCer的LAIV疫苗的猪感染CA04后，TX98和CA04特异性免疫细胞的频率都很高。有趣的是，与单独接种疫苗的猪相比，接种α-GalCer的猪往往具有更少的TX98-和ca04 -活性细胞。在肺中也得到了类似的结果，与单独接种疫苗的猪相比，接种α-GalCer的猪检测到较低浓度的TX98-和ca04 -活性细胞。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac和d)。总的来说，这些数据表明，TX98ΔNS1 LAIV疫苗接种诱导了针对CA04的异亚型细胞反应，而α-GalCer似乎减少了这些反应。gydF4y2Ba

疫苗和挑战病毒的复制gydF4y2Ba

所有三个接种组都开始以3d.p.i的速度排出LAIV。α-GalCer处理的猪的TX98ΔNS1水平与其他接种组相似(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa和b).攻毒后，未接种疫苗的猪脱出高水平的TX98和CA04。然而，所有未接种疫苗的ca04 -感染猪都以1d.p.i.的速度脱落病毒，而未接种疫苗的tx98 -感染猪则需要更长的时间才能脱落病毒，6头猪中有5头在3d.p.i.时呈阳性，还有一头猪仅在5d.p.i.时脱落病毒。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa). TX98刺激接种猪的鼻拭子中未检测到病毒。接种过CA04病毒的猪在1和3 d / i时的病毒释放水平与未接种过CA04病毒的猪相似。然而，无论是否注射α-GalCer，这些猪都能阻止病毒的释放，减少了5d.p.i。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba未接种疫苗的猪在BALF、气管、支气管和肺组织中具有高滴度的TX98和CA04(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac). TX98刺激接种猪的BALF或呼吸组织中未检测到病毒。同样，在未接种α-GalCer疫苗的ca04 -挑战猪的BALF、气管或支气管中未检测到病毒。此外，这些猪中只有3头肺样本呈病毒阳性。相反，病毒存在于所有α-GalCer处理猪的呼吸组织和BALF中，尽管其滴度低于假接种猪。总之，这些结果表明，TX98ΔNS1疫苗接种抑制了异亚型CA04病毒的复制，而LAIV疫苗与α-GalCer联合接种可降低这种效应。gydF4y2Ba

肺癌病理gydF4y2Ba

根据肺不张和肺炎影响的单个肺叶或总肺表面积的百分比，在尸检时评估宏观肺病理(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa和b)。未接种TX98疫苗的猪感染疾病的表面积比例最高，其次是CA04疫苗。接种TX98疫苗的猪肺部病变很少。相比之下，接种了未接种α-GalCer的猪和接种了CA04的猪有高水平的肺不张和肺炎，大多数肺叶与未接种的猪相当(图4)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).一个例外是左颅肺叶，与未接种疫苗的猪相比，未接种α-GalCer的接种猪有更少的肉眼病变。将疫苗与α-GalCer联合使用，可将ca04诱导的肉眼肺病变减少到仅接受疫苗的猪的大约一半(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab).显微肺病变的组织病理学评估也得到了类似的结果(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac).总之，这些数据表明，单独接种LAIV疫苗对CA04感染诱导的肺部病理没有显著影响。然而，用α-GalCer佐剂疫苗导致了肺部炎症评分的数值降低，这可能与在这些猪中发现的病毒反应细胞浓度较低有关。gydF4y2Ba

在这里，我们评估了使用α-GalCer来增加美国养猪业以前使用的LAIV疫苗所提供的异种和异亚型交叉保护(Ingelvac Provenza™;勃林格殷格翰动物保健美国公司，德卢斯，佐治亚州)(Genzow等。gydF4y2Ba2018gydF4y2Ba；夏尔马等人。gydF4y2Ba2020gydF4y2Ba)．我们的前提是基于先前的一份报告，该报告发现，在同种病毒致命感染后，经鼻内注射α-C-GalCer和类似LAIV疫苗的组合，与单独注射LAIV的小鼠相比，存活率显著提高(Kopecky-Bromberg等。gydF4y2Ba2009gydF4y2Ba)．比如我们的猪LAIV疫苗(Solórzano等。gydF4y2Ba2005gydF4y2Ba)，该LAIV使用8个质粒反向遗传系统生产，其中包括编码截断NS1蛋白的质粒(Kopecky-Bromberg et al.)。gydF4y2Ba2009gydF4y2Ba)．具有这种截断的病毒被高度削弱，因为NS1是抑制宿主干扰素反应所必需的(García-Sastre等。gydF4y2Ba1998gydF4y2Ba；Fernandez-Sesma等人。gydF4y2Ba2006gydF4y2Ba；Richt和García-SastregydF4y2Ba2009gydF4y2Ba)．TX98ΔNS1 LAIV疫苗为猪提供对同源野生型病毒的完全免疫，并对异源和异亚型IAV株提供部分保护(Solórzano等。gydF4y2Ba2005gydF4y2Ba；Richt等人。gydF4y2Ba2006gydF4y2Ba；文森特等人。gydF4y2Ba2007gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在我们的第一个实验中，我们确定了α-GalCer的剂量，以避免损害LAIV的生长，我们发现α-GalCer抑制LAIV的复制，并且100 μg/kg剂量倾向于降低对肺部疾病的保护。α- galcer介导的LAIV水平的降低并没有抑制疫苗抑制异源攻击病毒复制的能力。这可能是因为TX98ΔNS1 LAIV疫苗对CO99非常有效(Vincent et al。gydF4y2Ba2007gydF4y2Ba)并且在相当低的剂量下可能仍然有效。α-GalCer处理猪中LAIV水平的降低与α-GalCer处理显著降低ivv感染小鼠病毒水平的报道一致(Ho等。gydF4y2Ba2008gydF4y2Ba；De Santo等人。gydF4y2Ba2008gydF4y2Ba)．这与几种NKT细胞介导的先天免疫反应有关，包括I型(IFN-α， IFN-β)和II型(IFN-γ)干扰素的诱导，NK细胞招募到感染部位，以及骨髓细胞抑制活性的降低(Ishikawa等人)。gydF4y2Ba2010gydF4y2Ba；Ho等人。gydF4y2Ba2008gydF4y2Ba；De Santo等人。gydF4y2Ba2008gydF4y2Ba)．我们的结果与Kopecky-Bromberg等人的发现一致。gydF4y2Ba2009gydF4y2Ba)， who观察到高剂量α-C-GalCer消除了LAIV疫苗所提供的保护。这也与我们之前的研究一致，我们发现100 μg/kg α-GalCer鼻内给药于ivv感染的猪可以降低鼻拭子和肺组织中的病毒滴度(Artiaga et al.)。gydF4y2Ba2016 bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

我们的第二个实验研究了用50 μg/kg α-GalCer佐剂LAIV TX98ΔNS1是否能增加对异亚型病毒攻击的保护。我们发现，尽管鼻拭子中LAIV的脱落量没有减少，但这种剂量的α-GalCer降低了LAIV疫苗诱导交叉保护免疫反应和抑制病毒复制的能力。一个有趣的观察结果是，与单独接种LAIV疫苗的动物相比，接种α-GalCer疫苗的猪肺部病理水平较低。这可能部分是由于接种α-GalCer的猪肺部病毒特异性T细胞浓度较低，因为炎症细胞在气道组织中的积累是肺部炎症的重要因素(Humphreys et al.)。gydF4y2Ba2003gydF4y2Ba；佩吉特等人。gydF4y2Ba2011gydF4y2Ba；段和托马斯gydF4y2Ba2016gydF4y2Ba)．单独的LAIV疫苗对ca04诱导的肺部病理没有影响，这与之前的一份报告相吻合，该报告用不同的异亚型病毒株挑战TX98ΔNS1-vaccinated猪(Vincent et al。gydF4y2Ba2007gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

以体重为基础，50 μg/kg剂量的α-C-GalCer与Kopecky-Bromberg等人的1 μg/kg剂量相当(gydF4y2Ba2009gydF4y2Ba)用于增加LAIV接种小鼠的存活率(Kopecky-Bromberg et al.;gydF4y2Ba2009gydF4y2Ba)．有几个因素可能导致我们没有观察到类似的保护模式。首先，小鼠研究使用α-GalCer的衍生物，即α-C-GalCer，与α-GalCer相比，它诱导IFN-γ的增强和延长产生(Schmieg等。gydF4y2Ba2003gydF4y2Ba；藤井等人。gydF4y2Ba2006gydF4y2Ba)．其次，我们的研究测试了α-GalCer刺激异亚型免疫反应的有效性，与Kopecky-Bromberg等人使用的同源疫苗挑战方案相比，这种免疫反应更难诱导。(gydF4y2Ba2009gydF4y2Ba)．第三，猪的NKT细胞浓度远低于大多数近交系小鼠，且小鼠NKT细胞的组织分布和亚群与猪有很大差异(Artiaga等。gydF4y2Ba2014gydF4y2Ba；Yang等。gydF4y2Ba2017gydF4y2Ba；Lee等人。gydF4y2Ba2015gydF4y2Ba)．第四，小鼠不是宫内病毒的天然宿主，通常会比猪患上更严重的临床疾病，但没有宫内病毒特异性的临床体征(FrancisgydF4y2Ba1934gydF4y2Ba；Francis和MagillgydF4y2Ba1935gydF4y2Ba)．这在很大程度上是由于小鼠和猪抗病毒免疫防御的差异，其中包括一些序列相似性相对较低的非同源抗病毒基因(Pillai等。gydF4y2Ba2016gydF4y2Ba；斯塔布æk等人。gydF4y2Ba2018gydF4y2Ba)．最后，与猪相比，α-GalCer的鼻内传递途径可能更有效地刺激小鼠呼吸道中的粘膜NKT细胞，因为小鼠鼻腔通道与肺之间的相对距离比猪短得多。由于猪在解剖学和免疫学上与人类更相似，而不是小鼠，并且也是iav的天然宿主，因此猪很可能更准确地反映出人类对α-GalCer作为LAIV疫苗佐剂的反应。gydF4y2Ba

总之，我们的结果发现，添加α-GalCer的LAIV疫苗削弱而不是增强了对异亚型病毒挑战的免疫力。这可能是由于NKT细胞介导的先天反应抑制了LAIV疫苗的生长。使用低水平的α-GalCer有可能克服这一障碍。然而，由于猪和人之间的NKT细胞频率和效应子功能存在很大的异质性，即使非常低剂量的α-GalCer也会抑制某些个体中LAIV的生长，这是危险的。gydF4y2Ba

猪gydF4y2Ba

从中西部研究猪公司(Glencoe, MN)获得4周大的混合品种和性别的猪，并运输到堪萨斯州立大学的大型动物研究设施(Manhattan, KS)。动物被允许适应研究设施3天，然后被纳入实验。分别使用血凝抑制(HI)试验和RT-qPCR证实猪的H1/H3抗体和病毒脱落呈血清阴性(Kitikoon et al.)。gydF4y2Ba2014gydF4y2Ba；Sponseller等。gydF4y2Ba2010gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

病毒和疫苗制备gydF4y2Ba

LAIV疫苗最初是由H3N2 A/Swine/Texas/4199-2/1998 (TX98)流感病毒反向遗传产生的，如前面所述(Solórzano等。gydF4y2Ba2005gydF4y2Ba)．简单地说，LAIV编码一个截断的NS1蛋白，在126个读密码子后引入4个终止密码子，导致野生型NS1蛋白从219个氨基酸截断到126个氨基酸。剩余的野生型TX98遗传物质用于编码PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2和NS2。使用TranslT®-LT1转染试剂(Mirus Bio LLC, Madison, WI)转染编码每个基因片段的质粒，转染表达SV40大T抗原温度敏感突变体的HEK 293T人胚胎肾细胞。HEK 293T细胞随后与Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞共培养，然后从培养上清中回收的病毒颗粒进一步通过MDCK细胞繁殖。在目前的研究中，LAIV疫苗和挑战病毒是通过内部储存的MDCK细胞繁殖的。挑战病毒包括包含完整NS1基因的野生型TX98, H3N2 A/Swine/Colorado/23619/1999 (CO99)和H1N1大流行病毒A/California/04/2009 (CA04)。病毒亚型经Sanger测序确认。gydF4y2Ba

病毒滴定gydF4y2Ba

鼻拭子和BALF收集于DMEM (Corning, Corning, NY)中添加抗生素-抗真菌剂(Gibco Life Technologies, Carlsbad, CA)，使用0.45 μm注射器过滤器过滤，并保存于-80°C。气管、支气管和肺在DMEM中机械分离，DMEM中添加0.3%牛血清白蛋白(BSA, Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州)，1gydF4y2Ba⨯gydF4y2BaMEM维生素(Gibco)和1gydF4y2Ba⨯gydF4y2Ba抗生素-抗真菌(Gibco)使用TissueLyser II (Qiagen, Germantown, MD)和不锈钢珠。得到的组织匀浆经0.45 μm细胞过滤器过滤，在-80°C保存，直到进一步加工。gydF4y2Ba

病毒滴度由组织培养感染剂量(TCID)的中位数(50%)确定gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba)，表示为TCID的对数变换值gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba/mL或TCIDgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba/g，视情况而定。简单地说，TCIDgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba通过在96孔微量滴度板中连续稀释病毒感染MDCK细胞来确定这些值。样品在37°C和5% CO中孵育gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在感染培养基(DMEM + 0.3% BSA + MEM维生素+抗生素-抗真菌药)中添加1 μg/mL L-(tosylamdo -2-苯基)乙基氯甲基酮(TPCK)处理的胰蛋白酶(Worthington生化公司，Lakewood, NJ)。对于组织匀浆样品，在3小时后将一系列稀释培养基改为含有tpck处理过的胰蛋白酶的新鲜感染培养基。含鼻拭子和BALF样本的平板在-20°C下用乙醇固定10分钟，并使用抗甲型流感核蛋白(NP)单克隆抗体(HB65杂交瘤ATCC, Manassas, Virginia)染色，随后用结合了根过氧化物酶(HRP)的兔抗小鼠免疫球蛋白二抗(Dako, Glostrup, Denmark)和3-氨基-9-乙基卡唑底物(AEC)孵育(电子显微镜科学，Hatfield, PA)。用同样的方法处理组织匀质样品，除了使用Alexa Fluor 488标记的多克隆山羊抗小鼠IgG (Invitrogen, Carlsbad, CA)作为二抗，以便通过间接免疫荧光来阅读样品。TCIDgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba用Reed and Muench方法(Reed and MuenchgydF4y2Ba1938gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

实验设计gydF4y2Ba

试验1,15头猪分为5个处理组，每组3头猪(表1)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和附加图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).第0天，2-5组猪鼻内注射2 mL DMEM(每个鼻孔1 mL)，含10gydF4y2Ba^6gydF4y2BaTCIDgydF4y2Ba_50gydF4y2BaTX98ΔNS1，与0(仅为载液)、10、50或100 μg/kg α-GalCer联合使用(Diagnocine LLC Hackensack, NJ)。α-GalCer原液(2 mg/mL)溶解在DMSO中，如前所述(Artiaga et al。gydF4y2Ba2014gydF4y2Ba)．1组用溶解在2 mL DMEM中的DMSO(溶解100 μg/kg α-GalCer的DMSO体积)假性接种猪。接种28天后，猪用肌肉注射tiletamine-zolazepam (Telazol®;4.4 mg/kg体重)和xylazine (2.2 mg/kg)gydF4y2Ba^6gydF4y2BaTCIDgydF4y2Ba_50gydF4y2BaCO99在2毫升DMEM中。在整个挑战期，分别在- 2,0,1,3,5,7,14,20 d.p.v和每天评估体温和临床体征。在- 2,20和33 d.p.v.时采集外周血，用流式细胞术分析免疫细胞群。在第2、7、14、20、28和33天采集血清，用HI法检测病毒特异性抗体。在挑战期间，在- 2,1,3,5d.p.v.和每天收集鼻拭子，以评估鼻分泌物中的病毒脱落。在5d.p.i (33 d.p.v)时，用噻他明-唑西泮和甲苯嗪麻醉猪，并以致死剂量戊巴比妥钠静脉注射(150 mg/kg体重)安乐死。用50 mL DMEM灌洗肺收集细支气管肺泡灌洗液。将肺组织和TBLN收集到DMEM中，流式细胞术分析免疫细胞。取右肺中叶加入福尔马林进行组织病理分析。第2组的一头猪在感染时死于麻醉并发症，并从分析中移除。gydF4y2Ba

在实验2中，将4窝的32头猪分为6个处理组，使每组每窝猪数量相近(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba；额外的无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).第0天，使用与实验1相同的方案鼻内接种猪。1、2、3组为假免疫组。第4组和第5组收到10份gydF4y2Ba^6gydF4y2BaTCIDgydF4y2Ba_50gydF4y2BaTX98ΔNS1。6组接种相同剂量LAIV疫苗联合50 μg/kg α-GalCer。接种后3周(21个d.p.v)， 2组和4组感染野生型10gydF4y2Ba^6gydF4y2BaTCIDgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba2 mL DMEM感染TX98, 3、5、6组感染相同剂量的CA04。同一天，第1组按照实验1所述进行安乐死和尸解。其余各组在5d.p.i. (26d.p.v.)时进行尸解。除了收集气管、支气管和肺叶的病毒滴度外，实验1的体温、临床体征、病毒滴度、组织病理学、免疫学分析和血清学分析与实验1相同。gydF4y2Ba

用于单细胞分离的组织加工gydF4y2Ba

如前所述，从外周血、BALF、肺组织和TBLN中分离出单细胞，并准备用于流式细胞术和ELISPOT检测(Artiaga et al.。gydF4y2Ba2014gydF4y2Ba；Artiaga等人。gydF4y2Ba2016年,一个gydF4y2Ba)．简单地说，血液样本通过静脉穿刺从颈内静脉收集到包有EDTA或肝素的真空管中(BD Biosciences, San Jose, CA)，组织样本收集到DMEM中。用氯化铵为基础的裂解缓冲液处理外周血以去除红细胞(RBC)。采用Ficoll-Paque™PREMIUM (GE Healthcare BioSciences Corp.， Uppsala，瑞典)密度梯度离心分离外周血单个核细胞(Artiaga et al.)。gydF4y2Ba2014gydF4y2Ba)．然后将细胞重悬在冷冻介质中[45% RPMI 1640 (ATCC)， 45%胎牛血清(FBS;Atlanta Biologicals, Flowery Branch, GA)和10% DMSO (Sigma-Aldrich)，并与异丙醇在-80°C的冷冻容器中缓慢冷冻24小时，然后转移到液氮中。将BALF样品离心，收集细胞球和上清液，分别分析免疫细胞和病毒滴度。取大约2克取自颅、中、尾叶的肺组织样本，用5 μg/mL的Liberase TL (Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim, Germany)在DMEM中37°C消化45分钟，通过100 μm细胞过滤器(Fisher Scientific)，用上述RBC裂解缓冲液处理。使用一次性组织研磨机(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)将TBLN均质成单细胞悬液，使用100 μm细胞过滤器过滤，并用RBC裂解缓冲液处理。单细胞在PBS中重悬，用0.4%台锥蓝染色，使用伯爵夫人™II自动细胞计数器(Life Technologies)计数细胞总数和活力。gydF4y2Ba

流式细胞仪和抗体gydF4y2Ba

细胞悬液用活性染料(LIVE/DEAD™Fixable Near-IR DEAD Cell Stain Kit, Invitrogen)孵育以排除死细胞，Fc用1mg /mL大鼠IgG (Sigma-Aldrich)溶液阻断，并在4°C下用指示的单克隆抗体(Abs)染色。使用CD3ε特异性抗体(BB23-8E6-8C8;BD生物科学)，CD4 (74-12-4;南方生物技术，伯明翰，AL)， CD8α (76-2-11;， CD8β (PPT23;Bio-Rad, Hercules, CA)， TCRδ (PGBL22A;WSU单克隆抗体中心(Pullman WA)， CD16 (G7;BD Biosciences)和CD11b (M1/70;BioLegend)。NKT细胞是使用pbs57负载的小鼠CD1d四聚体和来自美国国立卫生研究院四聚体核心设施的卸载CD1d对照四聚体进行鉴定的。 Monocytes, macrophages, and granulocytes were characterized using Abs specific for CD14 (MIL2; Bio-Rad), CD16, CD163 (2A10/11; Bio-Rad), CD172a (74-22-15A; BD Biosciences), CD11b, and MHC class II (H42A; WSU Monoclonal Antibody Center) (Additional Table1gydF4y2Ba及附加图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．染色细胞用PBS清洗一次，使用BD Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD Biosciences)固定，再用PBS清洗一次，然后使用BD LSRFortessa™X-20流式细胞仪和FACSDiva软件(8.0.1版本，BD Biosciences)获取。荧光- 1对照用于确定阳性和阴性群体。所有数据均使用FlowJo软件(版本10.7.0,Treestar, Palo Alto, CA)进行分析。gydF4y2Ba

ELISPOT试验gydF4y2Ba

将冷冻的PBMC在37℃水浴中解冻，用解冻介质(RPMI 1640和20% FBS)洗涤两次，重悬在培养基中[RPMI 1640, 10% FBS, 1%抗菌素-抗真菌剂，55 μM 2-巯基乙醇(Gibco)]，静置2小时。肺消化后分离的单细胞没有冷冻保存，而是立即使用。PBMC或肺细胞在96孔MultiScreen HTS板(Millipore, Billerica, MA)中以每孔0.5或100万个活细胞被镀，预涂有抗ifn -γ (P2G10, BD Biosciences)。然后细胞在37°C下以5 x 10孵育48小时gydF4y2Ba^5gydF4y2BaTCIDgydF4y2Ba_50gydF4y2Bauv灭活的TX98或CA04病毒颗粒或无病毒uv处理的MDCK上清液。随后，根据制造商说明，使用生物素偶联的抗ifn -γ单抗(P2C11, BD Biosciences)、链霉亲和素- hrp (BD Biosciences)和AEC底物(BD Biosciences)来开发板。使用ImmunoSpot S6 Micro Analyzer ELISPOT阅读器和ImmunoCapture 6.4软件(Cellular Technology Ltd.， Shaker Heights, OH)读取每个孔中的斑点数量。数据以每10个点的数量表示gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba在用脱毒MDCK上清培养的孔中，减去平均斑点数后的PBMC或肺细胞。gydF4y2Ba

嗨化验gydF4y2Ba

用受体破坏酶II (Denka Seiken, Tokyo, Japan)在37°C下处理过夜的血清样本进行血凝抑制试验，在56°C下热灭活60分钟，并与0.5%洗涤过的鸡RBC (Colorado serum Company, Denver, CO)在4°C下孵育60分钟，以去除非特异性凝集剂。这种处理导致样品从原始样品稀释为1:10，然后用PBS以1:2连续稀释。HI检测使用TX98、CO99或CA04病毒的4 HA单位作为抗原，如前所述，使用0.5%洗涤过的鸡红细胞(Kitikoon等。gydF4y2Ba2014gydF4y2Ba)．最高样品稀释，抑制病毒诱导的红细胞血凝被提出。gydF4y2Ba

病理学和组织病理学gydF4y2Ba

在尸检时，将肺从胸腔中取出，评估红色和凹陷区域(肺不张)影响的表面积百分比，这是ivv诱导的肺炎的特征。目视估计每个肺叶受肺炎影响的百分比，然后根据每个肺叶占总肺的相对比例计算每头猪的总分:左右脑叶和中叶各分配10%，副叶分配5%，左右尾叶各分配27.5%，共100% (Halbur et al.)。gydF4y2Ba1995gydF4y2Ba)．收集病变评分最高的右肺中叶，用10%中性磷酸缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，苏木精和伊红染色。对两段肺进行组织病理病变盲目评分。根据猪IAV感染通常相关的6个独立标准，使用先前描述的标准对每个肺切片从0到3进行评分:(i)上皮坏死、衰减或破坏;(ii)气道渗出坏死/炎症;(iii)呼吸道发生炎症的百分比;(iv)细支气管周围和血管周围淋巴细胞炎症;(v)肺泡渗出;(vi)肺泡间隔炎症(Khurana等。gydF4y2Ba2013gydF4y2Ba)．计算每头猪的总分。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

使用GraphPad Prism版本9.3.1 (GraphPad Software, San Diego, CA)对数据进行绘图和分析。采用Shapiro-Wilk检验评估数据的正态性。体温变化、NKT细胞频率和每叶宏观肺损害评分数据正态分布，并采用单向或双向方差分析(ANOVA)进行评估。当确定主效应或相互作用项显著时，使用土耳其的多重比较检验分离均值(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。HI滴度、IFN-γ ELISPOT检测、病毒滴度、全肺宏观病变评分和组织病理学病变评分的数据不是正态分布，因此使用非参数Kruskal-Wallis检验和Dunn’s多重比较检验进行分析。采用Mantel-Cox log-rank检验分析生存曲线。gydF4y2Ba

在这项研究中产生的所有数据都包含在这篇发表的文章中gydF4y2Ba附加材料文件gydF4y2Ba．额外的无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:实验时间表;额外的无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:门控策略识别外周血、BALF和组织中的免疫细胞群;附加的表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:用于流式细胞术的试剂。gydF4y2Ba

前言:gydF4y2Ba

抗体gydF4y2Ba

原子能委员会:gydF4y2Ba

3-amino-9-ethylcarbazolegydF4y2Ba

房颤:gydF4y2Ba

Alexa萤石gydF4y2Ba

方差分析:gydF4y2Ba

方差分析gydF4y2Ba

BALF:gydF4y2Ba

细支气管肺泡灌洗液gydF4y2Ba

BSA:gydF4y2Ba

牛血清白蛋白gydF4y2Ba

BV:gydF4y2Ba

灿烂的紫gydF4y2Ba

CA04:gydF4y2Ba

H1N1 A/加利福尼亚/04/2009甲型流感病毒gydF4y2Ba

CD:gydF4y2Ba

分化集群gydF4y2Ba

CO99:gydF4y2Ba

H3N2 A/猪/科罗拉多/23619/1999甲型流感病毒gydF4y2Ba

Cy:gydF4y2Ba

花青gydF4y2Ba

结论:gydF4y2Ba

感染后天数gydF4y2Ba

d.p.v。gydF4y2Ba

接种疫苗后的天数gydF4y2Ba

DC:gydF4y2Ba

树突细胞gydF4y2Ba

DMEM:gydF4y2Ba

杜尔贝科改良的鹰牌中号gydF4y2Ba

DMSO溶液:gydF4y2Ba

二甲亚砜gydF4y2Ba

EDTA:gydF4y2Ba

乙二胺四乙酸gydF4y2Ba

ELISPOT:gydF4y2Ba

酶联免疫吸收斑gydF4y2Ba

的边后卫:gydF4y2Ba

胎牛血清gydF4y2Ba

哈:gydF4y2Ba

血凝素gydF4y2Ba

HEK 293吨:gydF4y2Ba

人胚胎肾293细胞的可转染衍生物gydF4y2Ba

你好:gydF4y2Ba

血凝抑制gydF4y2Ba

合:gydF4y2Ba

辣根过氧化物酶gydF4y2Ba

i.n。gydF4y2Ba

鼻内gydF4y2Ba

信息技术。gydF4y2Ba

气管内的gydF4y2Ba

IACUC:gydF4y2Ba

动物保护和使用委员会gydF4y2Ba

IAV:gydF4y2Ba

甲型流感病毒gydF4y2Ba

IBC:gydF4y2Ba

机构生物安全委员会gydF4y2Ba

干扰素:gydF4y2Ba

干扰素(IFN-α， IFN-β， IFN-γ)gydF4y2Ba

搞笑:gydF4y2Ba

免疫球蛋白gydF4y2Ba

LAIV:gydF4y2Ba

减毒活流感病毒gydF4y2Ba

MDCK:gydF4y2Ba

马丁-达比犬肾gydF4y2Ba

MHC:gydF4y2Ba

主要组织相容性复合体gydF4y2Ba

N / A:gydF4y2Ba

不适用gydF4y2Ba

NK:gydF4y2Ba

自然杀伤细胞gydF4y2Ba

NKT:gydF4y2Ba

天生杀手TgydF4y2Ba

NP:gydF4y2Ba

核蛋白质gydF4y2Ba

NS:gydF4y2Ba

不重要gydF4y2Ba

NS1:gydF4y2Ba

非结构蛋白1gydF4y2Ba

PBMC:gydF4y2Ba

外周血单个核细胞gydF4y2Ba

PBS:gydF4y2Ba

磷酸盐缓冲盐水gydF4y2Ba

PBS57:gydF4y2Ba

Paul Savage博士及其同事开发的α-GalCer类似物gydF4y2Ba

体育:gydF4y2Ba

R-phycoerythringydF4y2Ba

PerCP:gydF4y2Ba

周围素叶绿素蛋白gydF4y2Ba

加拿大皇家银行:gydF4y2Ba

红细胞gydF4y2Ba

RDE II:gydF4y2Ba

受体破坏酶IIgydF4y2Ba

RPMI 1640:gydF4y2Ba

罗斯威尔公园纪念学院文化传媒1640年gydF4y2Ba

RT-qPCR:gydF4y2Ba

定量逆转录聚合酶链反应gydF4y2Ba

扫描电镜:gydF4y2Ba

均值的标准误差gydF4y2Ba

TBLN:gydF4y2Ba

气管支气管淋巴结gydF4y2Ba

TCID50:gydF4y2Ba

组织培养感染剂量中位数(50%)gydF4y2Ba

识别:gydF4y2Ba

T细胞受体gydF4y2Ba

TPCK:gydF4y2Ba

L-(tosylamdo -2-苯基)乙基氯甲基酮gydF4y2Ba

TX98ΔNS1:gydF4y2Ba

H3N2 A/Swine/Texas/4199-2/1998流感病毒含有截断的NS1蛋白gydF4y2Ba

TX98:gydF4y2Ba

H3N2 A/猪/德州/4199-2/1998甲型流感病毒gydF4y2Ba

紫外线:gydF4y2Ba

紫外线gydF4y2Ba

α-C-GalCer:gydF4y2Ba

Alpha-C-galactosylceramidegydF4y2Ba

α-GalCer:gydF4y2Ba

Alpha-galactosylceramidegydF4y2Ba

作者要感谢美国国立卫生研究院四元体核心设施根据HHSN272201300006C合同提供CD1d四元体，感谢堪萨斯州立大学比较医学小组的工作人员支持动物研究，感谢堪萨斯州兽医诊断实验室组织学实验室的工作人员提供H&E染色技术援助，感谢dashzevg Bold、Natasha Gaudreault、Cassidy Keating、Tammy Koopman、Yonghai Li的技术支持，Daniel Madden, Laxmi U Maheswar Rao Jakkula, David Meekins, Chester Mcdowell, Jinhwa Ransburgh, Jessie Trujillo和Michelle Zajac，以及Stephanie Hober, Rhonda Lund和Amanda Rezac的行政支持。额外的无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba由BioRender.com创建。gydF4y2Ba

这项工作由美国国立卫生研究院资助号HD092286 (JPD和JAR)，美国农业部资助号2016-09448 (JPD)，美国国家综合医学科学研究所(NIGMS)新兴和人畜共患传染病中心(CEZID)的AMP核心，资助号P20GM130448, NIAID支持的流感研究和应对卓越中心(CEIRR，合同号75N93021C00016)，NIAID资助的流感研究和监测卓越中心(CEIRS)拨款号HHSN272201400006C (JAR)，以及美国国土安全部拨款号DHS-2010-ST-061-AG0001 (JAR)用于新兴和人畜共患动物疾病卓越中心(CEEZAD)。gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 美国堪萨斯州立大学兽医学院诊断医学与病理生物学学系，曼哈顿，堪萨斯，66506gydF4y2Ba

   Bianca L. Artiaga, Igor Morozov, Russell Ransburgh, Taeyong Kwon, Velmurugan Balaraman, Sabarish V. Indran, Jamie Henningson, marwenjun & Jürgen A. RichtgydF4y2Ba

2. 密苏里大学动物科学部，哥伦比亚，MO, 65211，美国gydF4y2Ba

   Darling Melany De Carvalho Madrid & John P. DrivergydF4y2Ba

3. 佛罗里达大学动物科学系，盖恩斯维尔，佛罗里达，32611，美国gydF4y2Ba

   未红顾gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

所有作者都审阅并批准了这份手稿的最终版本。作者参与了构思(BLA, IM, JPD, JAR)、实验设计(BLA, IM, JPD, JAR)、数据采集(BLA, IM, RR, TK, VB, SVI, JH, WM, JAR, JAR)、数据分析(BLA, IM, DMCM, JAR, JPD)、数据解释(BLA, IM, JH, WM, JAR, JPD)、稿件撰写(BLA, WG, JAR, JPD)和稿件修改(BLA, JPD, JAR)。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba约翰·p·德莱弗gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准gydF4y2Ba

这些研究是根据2018年4月17日批准的项目号4067和2018年3月21日批准的机构生物安全委员会(IBC)注册文件号1284批准的堪萨斯州立大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的协议进行的。以及所有相关的地方、州和联邦法规和政策。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明在本研究中没有利益冲突。资助来源在研究设计和概念化、数据收集、分析或解释、撰写手稿或决定发表结果方面没有任何作用。JAR实验室在报告的工作之外得到了Tonix Pharmaceuticals、Genus plc、Xing Technologies和Zoetis的支持。JAR是用于治疗和预防病毒感染的抗病毒药物和疫苗的专利和专利申请的发明者，由堪萨斯州立大学拥有。作者Jürgen A. Richt没有参与期刊的评审或与此手稿相关的决定。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，允许以任何媒介或格式使用、分享、改编、分发和复制，只要您对原作者和来源给予适当的署名，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否有更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可协议中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包含在文章的创作共用许可协议中，并且您的预期使用不被法定法规所允许或超出了允许的使用范围，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查看本牌照的副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条所提供的资料，除非在资料的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba