荷斯坦奶牛不同饲料肠道消化特性的比较研究

本试验以泌乳期中国荷斯坦奶牛为试验对象，研究当地蛋白质饲料资源的营养价值。采用三步法(TSP)和改进的三步法(MTSP)测定在体外11种饲料瘤胃未降解蛋白质(RUP)消化率及其相关性。选择11种试验饲料进行风干，研究不同生长期和品种对饲料营养价值和RUP消化率的影响。精料中TSP对RUP的小肠消化率高于粗料，约为65%。大豆浓缩度最高(79%)，玉米浓缩度最低(65%)。DDGS(含可溶性酒糟)和SFM(葵花籽粕)的比例分别为70.9和74.9%。在粗饲料中，拔草期苜蓿的小肠消化率最高(55%)，全株玉米青贮的小肠消化率最低(40.5%)。当用MTSP法测定RUP的小肠消化率时，结果与TSP法相似。然而，这些数值普遍较高，两者之间有很强的显著相关性(R2= 0.967,P< 0.01)。这两种方法的对比研究有助于我们更好地了解不同饲料的小肠消化率，制定合理的饲料配方，有效预防疾病。

奶农通常通过给奶牛喂食高蛋白饲料(精料)来提高牛奶产量，但高浓度会降低饲料中有效物理纤维含量，减少瘤胃发酵，导致挥发性脂肪酸在瘤胃内积累，降低瘤胃pH值(Zhang等。2020)．当瘤胃pH值下降到一定水平时，可引起亚急性瘤胃酸中毒(SARA) (Khalouei等。2020)．低瘤胃pH值可引起瘤胃内革兰氏阴性菌增殖，分解并释放大量游离脂多糖内毒素(LPS)，可引起奶牛发病(Guo等。2016)．因此，有必要研究影响奶牛瘤胃内非降解蛋白质小肠消化率的不同因素，以更好地了解蛋白质饲料在奶牛消化系统中的降解情况。

许多报告表明，反刍动物最重要的营养限制因素之一是蛋白质(Harmon和Swanson。2020)．最近在反刍动物小肠蛋白质研究中的发现表明，可消化粗蛋白(DCP)。小肠中的DCP主要由微生物蛋白(MCP)、瘤胃未降解蛋白(RUP)和内源性蛋白的组合提供(Corea等。2020)．其中，RUP含量在30% ~ 50%之间变化，MCP含量稳定，内源性蛋白质在这三种形态中所占比例较小。RUP中的差异导致了DCP中的成分变化。氮在生长反刍动物体内的有效性是非常重要的，蛋白质在瘤胃内的降解速度和程度直接决定了这一指标。RUP的小肠消化率对牛奶产量和生长性能有重要影响。反刍动物饲粮中添加RUP可以提高蛋白质的有效利用(Lobos等。2021)．饲料蛋白质在小肠的供应显然是非常重要的，瘤胃未降解蛋白质在小肠的消化率与这一供应有关(Kaur et al。2011)．试验表明，反刍动物饲料小肠消化率与饲料种类、加工工艺、产地等诸多变化因素有关(Lolli et al.)。2021)．因此，研究瘤胃内不同原料对其小肠消化率的影响就显得尤为重要。

在过去的几十年里，许多关于小肠消化率的研究都使用了移动尼龙袋和在体外方法(De Boer等。1987；Promkot等人。2007)．这种测量方法需要将饲料通过瘘管放入反刍动物瘤胃内的尼龙袋中，并在瘤胃中孵育，以确定饲料蛋白质在瘤胃中的降解程度(Arisya等。2019)．一个三步在体外程序测量饲料氮，逃脱瘤胃降解和消化(Calsamiglia和Stern1995)．但是，为了确定移动尼龙袋技术的RUP，奶牛必须配备瘤胃和十二指肠套管。不可否认，实验小鼠和正常小鼠的生理结构是不同的。卡尔萨米格利亚和斯特恩表达了三步法的观点在体外过程(TSP)，采用综合瘤胃尼龙袋技术和在体外方法，模拟反刍动物的生理条件，易于标准化，经济(Calsamiglia和Stern1995)．Gargallo等人开发了一种改良的三步法在体外过程(MTSP)对TSP进行改进，并报告两种方法高度相关(R²= 0.98,P< 0.001)。MTSP需要更少的劳动力和时间，减少污染，并促进商业试验(Gargallo等。2006)．本研究的目的是利用TSP和MTSP对不同蛋白质来源的小肠消化率RUP进行理解，并为简化小肠消化率的检测方法提供理论基础。

营养成分

本研究中所用饲料的化学成分见表1．11种干物质(DM)饲料除玉米和大豆平均(SBM)外基本相同。玉米秸秆(CS)中中性洗涤纤维(NDF,75%)最高，酸性洗涤纤维(ADF, 42.1%)次之。玉米的ADF最低(1.8%)，SBM的NDF最低(15.3%)。粗蛋白质(CP)由低到高依次为CS、玉米干草(CH)、全株玉米青贮(WCS)、中国野麦草(CW)、玉米、AH、酒糟干及可溶性物(DDGS)、葵花籽粕(SFM)、SBM。对3个苜蓿品种在拔节期、盛花期和荚果期进行了刈割试验。CP含量随生育期的延长呈下降趋势，而PDF、ADF和酸性洗涤木质素(ADL)含量呈上升趋势。

瘤胃中CP的测定

数字1为不同饲料成分下瘤胃内CP的16 h降解率。结果表明:精料饲料(玉米、SBM、DDGS、SFM) CP在瘤胃内的降解速度高于粗饲料，其中SBM降解速度最快，达68.29%;但粗饲料中as的降解率高于其他饲料，达49.19%。

RUP的小肠消化率

原TSP和修改后TSP相关数据测量见表2．RUP的小肠消化率见表3.和无花果。2．在TSP法中，SBM和SFM的消化率较高。浓缩饲料中RUP的小肠消化率约为65%，高于粗饲料。在粗饲料中，ASS的RUP肠道消化率最高，约为55%，而WCS的肠道消化率最低，约为40.5%。这一发现也适用于MTSP方法。

此外，对11种饲料进行配对t检验，比较不同方法。MTSP法的实验值均高于TSP法，经配对t检验，差异显著。

相关分析

对RUP小肠消化率的数据分析表明，考虑RUP小肠消化率时，TSP法与MTSP法之间存在高度正相关(Y = 1.1864X + 5.7186，R²= 0.967,P< 0.0001)。TSP法和MTSP法对不同饲料的试验结果有较好的相关性。但在瘤胃内孵育16 h后，饲料CP含量与肠道消化后无显著相关性(表2)4)．

在本研究中，生饲料中SBM的CP含量(43.15)与之前的研究报道相似(Yao et al。2007；Promkot等人。2007)．玉米CP含量与C. Mikolayunas (Antoniewicz et al.)报道的结果相当。1992)，而DDGS则在D.H. Kleinschmit (Kleinschmit et al.;2007)．A.P. Santos报告说，与SBM相比，高RUP来源是酒糟干谷物(DDG)、DDGS和加热SBM (HSBM) (Santos等人)。1998)．CP可降解性在体外反刍动物饲料胃蛋白酶-胰蛋白酶消化率的研究近年来得到了广泛的报道。他们得出了同样的结论，浓缩饲料中RUP的小肠消化率高于粗饲料。Kleinschmit利用TSP法研究了不同产地DDGS在瘤胃内孵育12 h后的小肠消化率，得出结论:本试验TSP法消化率为70.9%，MTSP法消化率略高(Kleinschmit et al.)。2007)．这可能是由于瘤胃内孵育时间不同所致。C. Promkot报道，木薯干草、SBM和DDG的小肠消化率分别为70.4%、79.8%和71.7% (Promkot et al.;2007)．《奶牛营养需求》研究了DDGS、玉米、SBM、CS和苜蓿草粉中RUP的小肠消化率，分别为80、90、93、70和75% (NRC)2001)．在此试验条件下，TSP方法结果略低于NRC，而MTSP方法与NRC相同。高蛋白、低纤维饲料容易被小肠消化利用(Zhao和Yuanjun2017)．玉米秸秆蛋白质的瘤胃降解率低于玉米秸秆青贮，这与本实验一致。

用TSP法测定粗饲料中RUP的小肠消化率低于精料。这可能是由于饲料蛋白在瘤胃内被降解，剩余部分与木质素结合，难以消化。MTSP法也有相似的结果，但实测值略高于TSP法。一种可能的解释是，在瘤胃内孵育后，残体中的多肽和小肽被三氯乙酸沉淀。在本试验中，对RUP小肠消化率的数据分析表明，TSP法与MTSP法对RUP小肠消化率具有较高的正相关，相关检验与配对t检验结果一致。与Gargallo的研究结果相似，MTSP = 1.37 × TSP - 15.45 (R²= 0.98,P< 0.001 (Gargallo et al。2006)．

Wang报道了用TSP和MTSP测量13种浓缩物中的RUP (Wang和Fang2012)．他们的结果低于本次试验的结果，这可能与饲料种类、产地等因素有关。据报道，改进分三步进行在体外与移动尼龙袋法测定结果比较，测定结果为0.8383。

Kleinschmit利用TSP法研究了不同产地DDGS在瘤胃内孵育12 h后的小肠消化率，得出TSP法消化率为70.94%，MTSP法消化率略高(Kleinschmit et al.)。2007)．这可能是由于瘤胃内孵育时间不同造成的。

浓缩饲料中RUP的小肠消化率高于粗饲料。以SBM最高(79.0%)。使用TSP时，RUP和WCS的小肠消化率最低(40.5%)。用MTSP测定RUP的小肠消化率略高于用TSP测定，两者之间存在较强的显著相关性。与TSP相比，该方法一次最多可测量120个样品，比TSP更快、更高效。MTSP还避免使用具有腐蚀性、有毒和污染环境的三氯乙酸，便于评估饲料消化率RUP。

综上所述，奶牛对饲料的瘤胃消化和肠道消化是一个复杂的过程，研究奶牛对RUP的小肠消化率有助于了解奶牛对不同饲料消化的差异。为奶牛提供更完整、均衡的膳食，可以提高抗病性，降低疾病发病率。这些研究也为泌乳奶牛的饲粮制备提供了理论依据。

实验动物与设计

试验选用4头平均体重为550(±28)kg、日产奶量为20(±2.3)kg、泌乳期为156(±8.2)天的中国荷斯坦奶牛。全混合日粮(TMR)与饲粮的浓度比为45:555)．每天两次，分别在早上06:30和下午04:30自由喂食。试验期间保证淡水。饲料在实验前十天开始。本实验制备了11种可通过2.5 mm筛的精矿。饲料均来自呼和浩特土豆泥左旗。11种浓缩物分别为玉米、SBM(豆粕)、DDGS(酒糟及可溶物)、SFM(葵花籽粕)、CS(玉米秸秆)、WCS(全株玉米青贮)、CH(玉米干草)、CW(中国野草)、ASS(苜蓿平整期刈割)、AFS(盛花期)和APS(豆荚期)。选择3个品种的ASS、AFS和APS，研究不同生育期和品种对饲料营养价值和RUP消化率的影响。试验在呼和浩特市托莫特左旗小丹坝牧场进行。

化学分析

所提供的样品在65°C下干燥5小时，以去除其初始水分。根据水分测量方法对样品进行DM分析(Seymour et al。2019)．本实验采用Kjeldahl法(AOAC, 1990)测定CP，采用Van Soest法测定PDF、ADF和adl (Soest和Jung)1995)．

原始茶匙

每头牛有三条平行线。尼龙袋在早上喂食前一小时孵育，取出，清洗，并在65°C下干燥至恒定重量。饲料在瘤胃内预孵育16 h后，用自来水冲洗，测定残渣CP水平。将残留(15 mg N)与10 mL HCl (pH 1.9)(含1 g/L胃蛋白酶(Sigma P-7012)一起引入50 mL离心管。试管在38℃恒温旋转孵育1小时，然后加入13.5 mL胰蛋白酶溶液(pH值7.8磷酸盐缓冲液，50 ppm百里香酚，3 g/L胰蛋白酶(Sigma P-7545))，在38℃恒温旋转孵育24小时。24 h后加入3 mL 100%三氯乙酸，静置15 min，离心(10000 rpm, 15 min)收集上清液。采用凯氏定氮法(AOAC, 1980)分析上清液中氮含量。计算公式如下:

修改茶匙

样品测试也采用改进后的TSP进行。简单地说,1∼在瘤胃中孵育16小时后，每个样品取2 g残渣称量成3个重复袋。残渣密封在尼龙袋(R510)中，放置在Daisy II型烧瓶中，每个烧瓶允许容纳30个尼龙袋。培养瓶中的溶液为2 L pH为1.9的盐酸溶液，含有1 g/L胃蛋白酶(P-7000, Sigma)。39℃孵育1 h后，取出尼龙袋冲洗，加入2 L胰蛋白酶溶液(0.5 mol/L磷酸盐缓冲液，50 ppm百里香酚，3 g/L胰蛋白酶(P-7545, Sigma))， 39℃孵育24 h。24 h后，取出尼龙袋冲洗，65℃保持不变。测定了残渣中CP的含量。

RUP的消化率公式如下:

统计分析

数据采用SAS 9.0的GLM程序进行处理。数据分析采用完全随机设计的配对t检验。实验中将TSP法和MTSP法作为随机效应处理。采用方差检验对11种饲料原料进行了统计评价。利用SAS中的CORR程序检验标准化TSP和MTSP方法在确定RUP小肠消化率时的关系。

本研究中使用或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

ADF:

酸性洗涤纤维

分布:

酸性洗涤剂木质素

AFS:

盛开的阶段

APS:

圆荚体阶段

驴:

苜蓿在抽穗阶段被割

CF:

粗纤维

CH:

中国wildrye

CP:

粗蛋白

CS:

玉米杆

连续波:

中国wildrye

糖尿病:

干物质

DDGS:

酒糟与可溶性干粉

MCP:

瘤胃微生物蛋白

项目:

改进的三步法

美国核管理委员会:

奶牛的营养需求

NDF:

中性洗涤纤维

RUP:

瘤胃不可降解蛋白质

座:

大豆的意思

SFM:

向日葵餐

咯:

全混合比

茶匙:

三步法

WCS:

全株玉米青贮

不适用。

内蒙古卫生科技计划项目(202201108)。

内蒙古医科大学青年培训项目(YKD2021QN006)。

作者指出

1. 韩帅和张凡对这项工作的贡献相当。

作者及隶属关系

1. 内蒙古医科大学实验动物中心，内蒙古医科大学，呼和浩特

   韩帅，朱晓伟

2. 天津医科大学肿瘤医院，国家癌症临床研究中心，癌症防治重点实验室，天津

   张的粉丝

3. 内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特

   赵艳丽，郭晓宇，闫素梅

贡献

韩帅:AB/FG。张帆:AB/FG。颜素梅:FG。朱晓伟:ES。赵艳丽:ES。郭晓宇:ES。作者阅读并批准最终的手稿。

相应的作者

对应到Sumei严．

伦理批准并同意参与

本研究及其实验步骤由内蒙古医科大学机构动物护理使用委员会批准(批准号:内蒙古医科大学动物护理使用委员会批准)。SYDWZX202103001)。所有动物安置和实验都严格按照护理和使用实验动物的机构准则进行。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

我在此声明，本手稿的共同作者，熟悉其内容，同意以所提供的形式在动物疾病,所有作者都宣称不存在利益冲突。

出版商的注意

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