反应性神经胶质- gaba能神经元重编程:缓解难治性癫痫的“点金术”策略

这篇评论强调了最近发表在细胞干细胞“在近颞叶癫痫的小鼠模型中，将反应性神经胶质重新编程为中间神经元减少慢性癫痫发作活动”。一般来说，Lentini等人揭示了一种实现体内胶质-神经元重编程的策略，这是一种治疗顽固性癫痫的潜在疾病修饰策略。在此，我们根据这篇研究文章描述了难治性癫痫治疗方面令人兴奋的研究进展，总结了其主要发现，强调了其重要性，并提供了进一步的讨论。并提出了值得进一步研究的问题，以期更好地实现临床翻译。

近颞叶癫痫(mTLE)是难治性人类癫痫的最常见形式之一［1］．它通常以局灶性认知障碍癫痫复发为特征，并与海马硬化相关，其组织病理学特征为神经元丧失和反应性胶质细胞增生[2］．值得注意的是，海马gaba能中间神经元的显著损失[3.]，导致神经元兴奋和抑制之间的不平衡，长期以来一直被认为在癫痫发作的各个阶段，包括癫痫发作的开始，传播和结束，发挥关键作用。因此，通过药物、光遗传学、gaba能祖细胞移植等多种方法增强gaba能的传递，在控制癫痫发作中发挥着重要作用。然而，由于泛gaba能药物在全脑分布的靶点不特异性，常出现副作用。同时，gaba能神经元的光遗传激活需要病毒载体的共同管理，遗传操作，以及特异性光刺激。此外，细胞移植是一种具有高度侵入性的方法，存在伦理问题和潜在的肿瘤形成风险;同时，还需要长期的免疫抑制。总的来说，它们在临床转译潜力方面都有局限性。因此，人们正在探索通过诱导残留细胞增殖或通过其他驻留细胞的命运转换来促进自我修复的替代策略。

在最近发表于细胞干细胞［4]， Lentini等人提供了一种优雅的策略，将体内活性胶质细胞(已报道在癫痫中发挥促癫痫作用)转化为gaba能诱导神经元(iNs)。他们还证明了这些gaba能iNs可以功能稳定地整合到癫痫回路中，并在一个成熟的mTLE动物模型中产生高治疗效果。

首先，作者证实了kainite (KA)诱导的慢性mTLE模型不仅在所有亚型的海马体中有gaba能中间神经元的显著损失，而且还出现了反应性胶质细胞的大量增殖。开创性的体外研究在胚胎前脑发育过程中通过表达指导这些不同神经元亚型生成的转录因子，将培养的胶质细胞命运转化为iNs方面取得了相当大的进展[5］．根据他们之前的研究，背侧端脑命运决定神经原素-2的表达指导皮质星形胶质细胞成为谷氨酸神经元;同时，腹侧端脑命运决定因子achaette -schute同源物1 (Ascl1)或远端同源盒子2 (Dlx2)指导GABAergic身份。因此，作者选择Ascl1而且Dlx2在慢性mTLE小鼠模型中直接重编程，发现皮层胶质细胞具有强迫表达Ascl1而且Dlx2被重新编程为海马gaba能iNs。此外，免疫组化显示iNs单独表达血管活性肠肽(VIP;~ 40%)，生长抑素(SST;~ 30%)，或钙维甲酸(~ 30%)。有趣的是，未发现parvalbumin阳性iNs。这表明，目前的重编程策略虽然有前景，但可能不足以完全恢复内源性中间神经元的全谱。进一步的研究应提供微调重编程策略，以实现内源性中间神经元的完全恢复，这具有重要的治疗意义。

近年来，神经/胶质抗原2 (NG2)胶质细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞在体内重编程生成gaba能神经元，这使得胶质细胞到神经元的重编程成为一种很有前途的神经元替代策略[6］．然而，在病理情况下，如癫痫，这些iNs是否足以导致功能恢复仍然是一个重要的问题。因此，在本研究中，作者旨在开发一种策略，将癫痫小鼠的内源性海马胶质细胞原位转化为功能性gaba能iNs。他们发现注射逆转录病毒可以编码Ascl1而且Dlx2在KA注射后第5天有效地诱导海马胶质细胞重编程。大约75%的NEUN⁺iNs分化为gaba能神经元;有的表达VIP或神经肽Y，少量表达SST。虽然以这种方式产生的gaba能神经元的比例与将皮质神经胶质细胞移植到海马体不同，但这些结果有力地证明了增殖的成年mTLE小鼠反应性神经胶质细胞可以有效地转化为海马体中的gaba能iNs。根据作者之前的工作，皮质星形胶质细胞可以在体外重新编程并转化为谷氨酸能和gaba能神经元。在这项研究中，他们发现，通过强制表达Ascl1和Dlx2，移植到癫痫海马的原位反应性胶质细胞和皮质胶质细胞都可以转化为gaba能iNs。Chen等报道缺血性卒中后皮质星形胶质细胞过表达NeuroD1主要生成谷氨酸能神经元[7];然而，在他们最近的研究中，他们发现在癫痫大鼠模型中，海马星形胶质细胞中强制过表达NeuroD1将其转化为gaba能神经元[8］．这些结果表明，区域差异(包括来自微环境的外部因素)对神经元转化后的命运有显著影响。同时，起始种群对不同亚型神经元生成的影响仍然是一个有待解决的重要问题。即使使用相同的转录因子，当不同的起始细胞被靶向时，也会产生不同的神经元身份[6］．因此，针对本研究中靶向活性胶质细胞(即NG2胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞)的异质性，比较这些亚型对gaba能iNs的转化效率，以及癫痫患者体内的功能和特征，将有助于更精确、更有效的转化。

接下来，作者表明，iNs通过逆行单突触追踪策略，接受了来自许多突触前颗粒细胞(GCs)的神经支配，以及来自远端大脑区域(如内嗅皮层和乳腺/乳头上体)的投射。同时，这些iNs也在后续GCs的树突上形成突触钮扣。总之，这些发现表明，iNs是突触前和突触后的GCs的伙伴。此外，全细胞膜片钳记录显示，来自原位海马胶质细胞或移植星形胶质细胞的iNs具有生理功能，它们与GCs形成gaba能突触，事实证明，蓝光诱发的光遗传激活可靠地诱发了突触后抑制电位(IPSPs)，在GCs中发病时间约为3.5 ms。此外，记录的IPSPs被GABA的拮抗剂gabazine阻断_一个受体。这为iNs和GCs之间存在单突触连接提供了直接证据，并且胶质细胞转化的gaba能iNs在mTLE小鼠的海马体中具有功能。然而，gaba能iNs建立的突触强度是否与生理条件下建立的内源性突触相当或潜在不同，仍有待确定。此外，神经胶质细胞谱系重编程是否会影响局部微环境也值得未来研究。

最后，作者评估了GABAergic iNs在mTLE模型中的功能，发现这些GABAergic iNs显著提高了慢性癫痫自发性复发性癫痫(SRS)活性的降低(~ 50%)，表明有很好的抗癫痫作用。为了更好地理解GABAergic iNs的功能特征，作者在体外有效地设计了星形胶质细胞，同时进行了重编程过程，以便用化学发生方法适当地调节它们的活性。氯氮平介导的重新编程iNs的激发导致SRSs的频率和累积持续时间大幅降低~ 90%，在mTLE模型中证明了这些gaba能iNs的有效抗癫痫功能。由于gaba能神经元具有发散性、年龄特异性、活动依赖性和病理可变的作用，它们可能双向发挥抑制癫痫发作和促进癫痫发作的作用[9，10］．这一策略是否能够克服mTLE中的这两方面行为，值得进一步研究。此外，为了促进临床应用，可能会使用其他癫痫模型来测试“胶质-神经元重编程”策略的普遍抗癫痫效果。

总之，Lentini等人的研究揭示了一种优雅的策略，通过表达神经胶质到神经元的重编程Ascl1而且Dlx2在一个成熟的慢性mTLE小鼠模型中。结果表明，这些iNs具有gaba能，并能与GCs形成gaba能突触。此外，这些gaba能iNs可以显著降低癫痫慢性阶段的SRS活性，这表明一种有前途的治疗顽固性癫痫的策略(图2)。1)．尽管有这样的希望，两个问题可能仍然存在:(1)为什么Aslc1 / Dlx2-转导的细胞分化为gaba能神经元的亚型;以及细胞来源(星形胶质细胞、NG2胶质细胞或小胶质细胞)是否会影响重编程命运，从而影响抗癫痫疗效;(2)神经胶质细胞谱系重编程是否会影响局部微环境;iNs所建立的突触强度与gaba能神经元在生理条件下所建立的内源性突触强度是否相当或不同。鉴于齿状回与学习和记忆密切相关，确定重编程是否会促进mTLE的功能恢复和改善认知障碍将是有意义的。最后，“胶质-神经元重编程”等基因疗法的临床转化仍面临着一些障碍，包括基因编码方法的侵入性和基因治疗载体的不可逆性和毒性。同时，对人体的长期疗效和安全性也需要充分评估。然而，重编程因子在体内高效传递的快速发展可能促进神经胶质-神经元重编程策略的临床转化。

就像古希腊的“点石成金”故事一样，体内重编程方法有一种优雅的力量，可以把“石头”(“坏的”增殖胶质细胞)变成“金子”(“好的”gaba能诱导神经元)。通过强行表达Ascl1而且Dlx2在慢性癫痫中，癫痫海马中增殖的反应性胶质细胞可以成功地重编程并转化为gaba能iNs，并表现出抗癫痫发作的作用

全尺寸图像

不适用。

Ascl1：

achaette -schute同源物

Dlx2：

远程homeo盒子2

gc:

颗粒细胞

iNs:

诱导神经元

IPSPs:

抑制性突触后电位

mTLE:

近颞叶癫痫

喜欢的《忍者外传2》:

神经/胶质抗原2

风场:

生长激素抑制素

SRS:

自发性复发性发作

贵宾:

血管活性肠肽

不适用。

本研究由浙江省自然科学基金(Q22H309365)资助。

作者及隶属关系

1. 浙江中医药大学药学院第一临床医学院，浙江省神经药理学与转化医学重点实验室，浙江杭州310053

   陈俊姿，李忠霞

2. 浙江大学医学院邵逸夫医院药科，浙江杭州310020

   会上陈

贡献

所有作者收集参考文献，撰写手稿并准备图表。陈丽颖对手稿进行了实质性的修改。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到会上陈．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

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